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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 전통 발효 식품인 된장으로부터 악취감소효과를 나타내는 미생물을 분리하고 이들 중에서 효모균주를 분리하여 동정 하였으며 균학적특성과 악취감소효과를 분석하여 그 결과를 보고 하고자 한다.
제안 방법
- PCR반응은 94℃에서 4분간 predenaturation 시킨 후 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 2분 extension 하여 총 35 Cycle 실시하였으며 최종 DNA 합성은 72℃에서 10분으로 하였다. PCR 증폭산물은 1.5% agarose gel로 전기영동하여 Ethidium bromide 염색으로 확인 한 후 gel extraction kit (QIAGEN)로 PCR산물을 정제하고 염기서열 분석 후 NCBI의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 database와 염기서열의 상동성을 조사 하였다.
- 5 unit Taq polymerase(Promega)를 넣어 실시하였다. PCR반응은 94℃에서 4분간 predenaturation 시킨 후 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 2분 extension 하여 총 35 Cycle 실시하였으며 최종 DNA 합성은 72℃에서 10분으로 하였다. PCR 증폭산물은 1.
- PCR을 위한 반응 조건은 전체 PCR 반응액을 50 µL로 하였고 반응조성은 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 100 ng primer, 50 ng Template DNA, 2.5 mM dNTP, 및 2.5 unit Taq polymerase(Promega)를 넣어 실시하였다.
- 0 mL/mim 주입하였다. 교반속도는 100 rpm, 150 rpm 및 200 rpm으로 고정하여 악취가스 감소효과를 검토 하였다. 화학적 조건으로 탄소원으로는 glucose(Junsei co.
- 악취감소효과 미생물의 활성 검정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 단일군락의 균주를 돈분액(분과 뇨 혼합) 50 mL와 수돗물 50 mL가 혼합된 삼각플라스크에 접종하여 28℃에서 7일동안 진탕배양 후 관능검사(후각 이용)와 악취 가스 검지 가스관(GASTEC, 3 L, 3 M, 4 L, 4 LT, Japan)을 이용하여 행하였다.
- 돼지분변으로부터 돼지분변에 생육이 가능한 미생물을 분리하여 분리, 동정한 후 돼지분변 1L에 효모 배양액 1%를 접종하여, 10일 경과 후 황화수소가스의 변화량을 GC(Varion 3800)를이용하여 악취 감소효과를 분석하였다.
- 실험실에서 사용하고 있는 Soluble starch와 Yeast extract는 고가의 시약으로 산업화 할 경우, 경제성 부분을 고려해야 한다. 따라서 대량배양용배지로 사용할 수 있는 저렴한 탄소원으로 무수 포도당을, 질소원으로 Yeast extract를 선발하여 효모의 대량배양조건을 검토 하였다(Table. 2). Table.
- 분리한 악취 감소 효모는 YM 액체배지가 들어 있는 배양기(5 L,CNS Co.)를 이용하여 물리적 조건인 pH는 4.5, 6, 7, 8로 조절하였고, 공기공급량은 0.5 mL/mim으로 간격으로 1.0 mL/mim에서 3.0 mL/mim 주입하였다. 교반속도는 100 rpm, 150 rpm 및 200 rpm으로 고정하여 악취가스 감소효과를 검토 하였다.
- 교반속도는 100 rpm, 150 rpm 및 200 rpm으로 고정하여 악취가스 감소효과를 검토 하였다. 화학적 조건으로 탄소원으로는 glucose(Junsei co.), starch soluble(대정화금, 한국), 질소원으로는 yeast extract(오뚜기, 한국), 대두박(화성 전분, 한국), 무기염류로는 NaCl(대상, 한국) 등을 사용하여 효모의 생육과 악취감소효과를 조사 하였다.
대상 데이터
- 경기도 지방의 된장 시료로부터 악취감소 효과 미생물 중에서 효모가 분리되었으며 rDNA염기서열분석에 의하여 Pichia farinosa로 동정 되었다. 공시균주 P. farinosa NASS-2로 대량배양조건 확립 및 미생물처리제를 제조하였다. 분리한 효모로 제조한 악취저감효과 처리제의 실내 시험결과 돈분에 미생물제를 처리하고 15일 경과 후 악취가스 감소율을 조사한 결과, 암모니아가스(NH3 gas)는 처리 전 19.
- 주로 대부분 그람 음성 세균이 존재 하였는데, 이중 3종류의 효모가 분리 되었다. 그중에서 rDNA염기서열 분석에 의하여 효모균을 동정한 결과 Pichia farinosa 로 동정되었으며 P. farinosa NASS-2 균주를 본 연구에 이용하였다. 일반적으로 배양액면에 피막을 형성하는 산막효모가 존재하는 것을 알 수 있었다.
- 본 실험에 사용한 미생물 분리는 경기도 지방에서 채취한 된장시료로 부터 미생물을 분리하였다. 된장 1g을 YM medium(Difco.
이론/모형
- NH3−N함량 분석을 위하여 컬럼은 IonPac AS12A을 사용하였고, 이동상은 12.5 mM Na2CO3 + 17.5 mM이었고, NaHCO3 유속은 1.2 mL/min, 검출기는 Suppressed Conductivity, Detector SRS Current 100 mA, 시료주입량 25 µL의 조건을 이용하여 먹는물 수질 공정 시험 방법(환경부 고시 2002-91)에 준하여 NH3_N의분석을 행하였다.
- 얻어진 효모세포를 준비 하였다. 효모로부터 genomic DNA는 genomic DNA prep kit for yeast(Sol Gent Co.)을 사용하여 구입회사에서 제시한 방법에 준하여 추출 하였다. PCR을 위한 반응 조건은 전체 PCR 반응액을 50 µL로 하였고 반응조성은 10 mM Tris-HCl(pH 8.
성능/효과
- Table. 2 나타난 바와 같이 효모를 대량배양하는데 소요되는 생산비가 실험실용 배지 대비, 탄소원은 1/8, 질소원은 1/7의 수준으로 나타났다. 이는 악취감소효과를 가지고 있는 효모를 산업화 하고자 최적배지를 대량 생산에 사용할 경우, 생산비를 줄일 수 있는 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- Table 3에 나타낸 바와 같이, 악취감소효과를 갖는 다른 미생물인 Bacillus subtilis와 Pichia farinosa NAAS-2를 돈분에 처리한 결과, 처리전 596 ppt의 암모니아 가스 농도에서 Bacillus subtilis 처리구는 63.2 ppt, Pichia farinosa NAAS-2는 14.48ppt로 감소하는 효과를 얻을 수 있었다. 이같은 사실은 Bacillus subtilis IB 101을 이용하여 악취가스 제거하고자 할 때, 악취가스중 암모니아 가스를 20~30% 제거효과가 있다는 보고가 있지만(Kim et al.
- 경기도 지방의 된장 시료로부터 악취감소 효과 미생물 중에서 효모가 분리되었으며 rDNA염기서열분석에 의하여 Pichia farinosa로 동정 되었다. 공시균주 P.
- 경기도 지방에서 채취한 된장으로부터 돈분에서 발생하는 악취감소효과를 나타내는 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물들을 동정한 결과 Pseudomonas 10종, Corynebacterium 8종 외 39종의 세균과 효모를 분리 할수 있었다(Table 1). 주로 대부분 그람 음성 세균이 존재 하였는데, 이중 3종류의 효모가 분리 되었다.
- farinosa NASS-2로 대량배양조건 확립 및 미생물처리제를 제조하였다. 분리한 효모로 제조한 악취저감효과 처리제의 실내 시험결과 돈분에 미생물제를 처리하고 15일 경과 후 악취가스 감소율을 조사한 결과, 암모니아가스(NH3 gas)는 처리 전 19.49 ppm에서 처리 후는 1.38 ppm으로, 황화수소가스(H2S gas)는 처리 전 5.89 ppb에서 처리 후는 0.32 ppb으로 감소하는 효과를 나타내었다. 일반적으로 박테리아가 악취저감효과 미생물로 사용되고 있으나 본 연구에서 사용한 된장에서 분리한 효모 특히 산막효모인 P.
- 48ppt로 감소하는 효과를 얻을 수 있었다. 이같은 사실은 Bacillus subtilis IB 101을 이용하여 악취가스 제거하고자 할 때, 악취가스중 암모니아 가스를 20~30% 제거효과가 있다는 보고가 있지만(Kim et al., 2007) 본 실험에 사용한 Pichia farinosa NAAS-2는 돈분에 발생 되어지는 암모니아가스를 95%이상 가스를 제거하는 효과가 있어 일반세균보다는 월등한 악취효과 감소 효과를 나타나었다. 이는 가축분뇨 발효제의 개발을 위한 미생물 분리 연구에서 분리된 미생물이 암모니아가스를 95% 제거 하였다는 보고와 유사한 결과가 나타 나타나었다(Kim et al.
- 일반적으로 배양액면에 피막을 형성하는 산막효모가 존재하는 것을 알 수 있었다. 하지만 동정 결과 Pichia membrannefaciens 같은 맥주와 포도주등에 균막을 형성하는 유해균은 발견되지 않았다.
후속연구
- 하지만 보고된 미생물 대부분 세균이고 효모가 악취가스 효과를 나타낸다고 보고는 거의 없는 실정이다. 따라서 P. farinosa NAAS-2로 제조한 악취감소 처리제를 축산물폐기물(돈분뇨)에 Bioremediation agents로 사용한다면 환경 친화적인 처리제로 활용 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이는 악취감소효과를 가지고 있는 효모를 산업화 하고자 최적배지를 대량 생산에 사용할 경우, 생산비를 줄일 수 있는 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 특히 실험에 사용한 무수포도당과 효모엑기스의 경우 식품산업에서 사용하고 있는 재료로, 환경오염, 인축에 미치는 해로운 영향이 없고, 악취 감소효과 효모의 생육이 양호하여 대량생산하는 생산용 배지로서 사용이 가능 할 수 있을 것이다.
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