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문제 정의
- alginolyticus와 이에 대한 특이적인 파아지를 분리 동정 하였다. 분리된 V. alginolyticus에 대한 파아지의 생물학적인 특성을 조사하여 Vibrio 질병에 대한 예방 및 치료 대책의 가능성을 확보하고자 본 연구를 수행 하였다.
- , 2008) 항생제에 대한 대체제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 이에 본 연구에서는 V. alginolyticus에 대한 특성을 규명하고 이를 사멸 시킬 수 있는 항생제 대체제로서 파아지를 개발하고자 하였다. 우선 V.
- 그 중 tetracycline은 국내에서 가장 사용량이 많으며 그람 양성 및 음성 균에 모두 유효한 광범위 항생제이다. 이에 본 연구에서는 분리된 파아지가 V. alginolyticus에 대해 tetracycline 항생제와 비교하여 균 사멸에 얼마만큼의 효과가 있는지를 알아보고자 하였다. Fig.
- 이에 본 연구에서는 항생제 대체제로서 V. alginolyticus에 대한 파아지를 개발하기 위해 서해안 양식장의 해수와 어·패류로부터 V. alginolyticus와 이에 대한 특이적인 파아지를 분리 동정 하였다.
- 항생제 중 Vibrio 치료제로서 일반적으로 사용되고 있는 tetracycline을 대조군으로 설정하고 분리된 파아지가 V. alginolyticus에 대하여 억제 및 사멸능 효과가 있는지 알아보기 위하여 실험을 진행하였다. Eppendorf tube에 2% NaCl이 첨가된 BHI 액체배지를 800 µL씩 조성 한 다음 30 µg/mL의 tetracycline 또는 20배 희석된 파아지를 각각 100 µl씩 첨가 하였다.
제안 방법
- DNA sequencing에 사용된 V. alginolyticus의 16S rRNA gene에 대한 universal primer로 F, 5′-AGAGTTT-GATCMTGGCTCAG–3′, R, 5′-TACGGYTACCTTGT-TACGAC– 3′을 각각 사용하였다.
- Eppendorf tube에 2% NaCl이 첨가된 BHI 액체배지를 800 µL씩 조성 한 다음 30 µg/mL의 tetracycline 또는 20배 희석된 파아지를 각각 100 µl씩 첨가 하였다.
- V. alginolyticus에 특이적인 파아지의 역가를 측정하기 위해 2% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion (이하 2% NaCl-BHI)에 0.7% 한천을 혼합한 평판 배지를 사용 하였으며 auto-clave 한 후 cap tube에 5 mL씩 분주하여 사용하였다.
- alginolyticus 3×103 CFU/mL과 2×105 CFU/mL을 각각 100 µL 접종 한 후 37 ℃에서 2, 4, 6, 8, 10 및 12시간 경과 별로 각각의 샘플을 10진 희석법으로 희석하여 주입 평판법으로 생균수를 측정하였다.
- alginolyticus 100 µL를 첨가하고 37 ℃에서 2시간 간격으로 배양하였다. 그 후 주입 평판법으로 생균수를 측정하여 파아지의 역가를 측정 하였다.
- 다른 미생물들에 오염되었을 가능성이 있는 수집된 물 샘플을 정제하고자 물 샘플 100 ml을 filter paper (Macherey-nagel, Germany)로 1차 여과한 후 8,800 g에서 30분간 원심분리를 하였다. 파아지가 존재 가능한 상청액을 0.
- 약 12시간 후 대조군에 비해 박테리아가 증식되지 않는 것이 관찰되면 더 많은 양의 파아지를 증폭시키기 위해 박테리아 5 µL를 더 첨가하여 37 ℃에 지속적으로 배양하면서 박테리아의 증식여부를 관찰하였다.
- 여과된 파아지 샘플 10 µL를 원균주인 V. alginolyticus 500 µl가 균일하게 도말되어 있는 3% NaCl-BHI 배지에 접종하여 나타나는 monolayer spot plaque형태를 관찰하였다.
- alginolyticus에 대한 특성을 규명하고 이를 사멸 시킬 수 있는 항생제 대체제로서 파아지를 개발하고자 하였다. 우선 V. alginolyticus를 서해안 양식장의 해수와 어패류로부터 분리 동정 하였으며 이에 대한 특이적인 파아지를 분리하여 그에 대한 생물학적 특성을 조사하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 Vibrio 질병에 대한 예방 및 치료 대책의 가능성이 수월해 질 것으로 생각된다.
- 이후 V. alginolyticus가 더 이상 자라지 않는 것을 확인한 후 파아지가 있는 것으로 추정되는 배양액을 800 g로 원심분리하였으며 상청액을 0.2 µm 실린지 필터로 여과하였다.
- 정제된 물 샘플 내에 존재 가능한 V. alginolyticus 표적 세포에 특이적인 파아지를 증폭시키기 위해 멸균증류수 100 ml 당 NaCl (sodium chloride) 2 g, Yeast Extract (BactoTM) 0.5 g 및 Peptone (BactoTM) 1.0 g 되도록 제조한 후 pH 7.5로 조정하여 사용했다.
- 이는 앞서 언급하였던 monolayer spot assay 결과와 유사하였다. 증식된 균이 파아지에 대한 내성이 있는지 확인하기 위하여 추가적으로 25배 희석 샘플의 증식 균을 재분리 하여 파아지로 재감염을 시도하였다. 그 결과 처음부터 파아지에 내성을 보인 균주는 대조군과 똑같이 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 증폭된 파아지의 역가를 알아보기 위하여 정제된 파아지의 원액을 2% NaCl-BHI 액체배지를 사용 하여 5배, 10배, 20배, 25배 및 50배까지 희석하였다. Eppendorf tube에 2% NaCl-BHI 액체배지를 800 µL씩 조성한 다음 각각 희석시킨 파아지 샘플 100 µL와 103 colony forming unit (CFU)/mL의 V.
- 파아지가 존재 가능한 상청액을 0.2 µm 여과지로 2차 여과를 하였으며 0.2 µm 실린지 필터(Minisart, USA)를 이용해 3차까지 여과 하였다.
대상 데이터
- alginolyticus 3×103 CFU/mL과 2×105 CFU/mL을 각각 100 µL 접종 한 후 37 ℃에서 2, 4, 6, 8, 10 및 12시간 경과 별로 각각의 샘플을 10진 희석법으로 희석하여 주입 평판법으로 생균수를 측정하였다. 이때 대조군으로는 V. alginolyticus만 접종 한 것을 사용 하였다.
- 작년 여름 7-8월 경 우리나라의 서해안 및 남해안에 위치한 100여 군데의 양식장으로부터 해수 샘플을 수집하였다. 전복과 넙치의 병어로부터 멸균 면봉을 이용하여 병원성 세균을 채취한 후 alkaline peptone water (APW)에 증균 배양 하였으며thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS)를 선택배지로 하여 자란 균 집락을 API20E kit (BioMerieux, France)와 16S rRNA gene을 이용하여 분석해 본 결과 V.
이론/모형
- 증폭된 파아지를 농축시키기 위해 20% polyehthylene glycol 6000 (PEG 6000)과 3% NaCl을 넣고 4 ℃에서 하룻밤 정치한 후 10,000 g에서 30분 원심 분리 하는 PEG 침전법을 사용하였다. 파아지의 정제는 CsCl 밀도구배 원심분리법를 이용하였다.
- 증폭된 파아지를 농축시키기 위해 20% polyehthylene glycol 6000 (PEG 6000)과 3% NaCl을 넣고 4 ℃에서 하룻밤 정치한 후 10,000 g에서 30분 원심 분리 하는 PEG 침전법을 사용하였다. 파아지의 정제는 CsCl 밀도구배 원심분리법를 이용하였다. CsCl의 구배를 ρ 1.
성능/효과
- alginolyticus에 대해 tetracycline 항생제와 비교하여 균 사멸에 얼마만큼의 효과가 있는지를 알아보고자 하였다. Fig. 4는 in vitro상에서 파아지 VAP11와 Vibrio 치료제로서 사용되어지고 있는 tetracycline을 사용하여 V. alginolyticus 103과 105 CFU/mL의 농도별에 대한 사멸되는 수준을 비교한 결과로서 V. alginolyticus 103 CFU/mL의 농도에서는 파아지 VAP11와 tetracycline 모두 대조군 비하여 2시간 만에 균을 사멸 시키는 것으로 나타났다. V.
- alginolyticus 103 CFU/mL의 농도에서는 파아지 VAP11와 tetracycline 모두 대조군 비하여 2시간 만에 균을 사멸 시키는 것으로 나타났다. V. alginolyticus 105 cfu/mL의 농도에서는 2시간 까지는 파아지 VAP11이 tetracycline 보다 좋았으나 이후부터는 대조적으로 균이 증가되는 현상을 보였으며 tetracycline의 경우 2시간부터 생균수가 점차 감소되어 8시간 이후 생균수가 모두 사멸되어지는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 앞서 실험된 monolayer spot의 결과와 유사한 현상이라 생각된다.
- 증식된 균이 파아지에 대한 내성이 있는지 확인하기 위하여 추가적으로 25배 희석 샘플의 증식 균을 재분리 하여 파아지로 재감염을 시도하였다. 그 결과 처음부터 파아지에 내성을 보인 균주는 대조군과 똑같이 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- (2002)이 보고한 결과와 유사하게 두 균 모두 양성 반응을 보였다. 또한 대조군으로 사용한 표준 균주인 V. alginolyticus ATCC 17749와 유사한 생화학적 특성을 나타내었으며 16S rRNA 염기서열 분석 결과 Genbank에 등록된 accession number HM771350.1인 V. alginolyticus과 99.7% 상동성을 나타내었다 (자료 미 제시). 일백 여 개에 달하는 다양한 해수 샘플을 처리한 결과 V.
- 본 연구에서는 해수 및 어패류로부터 V. alginolyticus라고 추정되는 8개의 균주를 얻었으나 육안적으로 형태 및 크기가 유사하여 동일한 균주로 간주하고 그 중 전복샘플에서 분리한 한 균주를 분리 동정하였다. 선택된 균주는 KCTC에서 분양 받은 표준 균주인 V.
- alginolyticus라고 추정되는 8개의 균주를 얻었으나 육안적으로 형태 및 크기가 유사하여 동일한 균주로 간주하고 그 중 전복샘플에서 분리한 한 균주를 분리 동정하였다. 선택된 균주는 KCTC에서 분양 받은 표준 균주인 V. alginolyticus ATCC 17749와 집락의 색깔이나 형태가 동일하였으며 API20E kit로 실험한 결과 lysine decarboxylase, ornithin decarboxylase, indol, glucose, mannitol, sucrose 및 oxidase에는 Park et al. (2002)이 보고한 결과와 유사하게 두 균 모두 양성 반응을 보였다. 또한 대조군으로 사용한 표준 균주인 V.
- 하지만 37℃ 배양 과정에서 24시간 이전에 다시 약간의 용균 반점이 덮이는 현상이 나타났는데 이러한 현상은 기존에 보유하고 있는 양성 균주의 일종인 Mycobacterium sp.의 파아지 그리고 음성 균주의 일종인 Edwardsiella tarda (E. tarda)의 파아지와 비교해 보면 확연한 차이가 남을 알 수 있었다. 그 이유로는 용균성 파아지의 복제과정 중 일부의 박테리아가 살아남아 파아지 감염에 대한 박테리아의 내성이 발생되었을 가능성을 들 수 있다.
- 일백 여 개에 달하는 다양한 해수 샘플을 처리한 결과 V. alginolyticus에 대한 특이 파아지 1주가 분리·동정되었으며 이를 VAP11이라 명명하였다.
- 작년 여름 7-8월 경 우리나라의 서해안 및 남해안에 위치한 100여 군데의 양식장으로부터 해수 샘플을 수집하였다. 전복과 넙치의 병어로부터 멸균 면봉을 이용하여 병원성 세균을 채취한 후 alkaline peptone water (APW)에 증균 배양 하였으며thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS)를 선택배지로 하여 자란 균 집락을 API20E kit (BioMerieux, France)와 16S rRNA gene을 이용하여 분석해 본 결과 V. alginolyticus로 확인 되었다. DNA sequencing에 사용된 V.
- 만약 그렇다면 파아지에 대한 내성균주가 어떻게 생성될 수도 있는 지 정확한 메커니즘을 조사하기 위해는 추가적인 실험이 요구된다. 파아지의 역가를 측정한 결과 5배에서 20배 희석 시까지 파아지가 첨가된 샘플은 숙주 균이 모두 사멸되어 균이 검출 되지 않았으며 25 및 50배 샘플의 경우에는 대조군에 비하여 감소는 되는 듯하였으나 2시간 이후부터 균이 모두 증식하여 대조군과 비슷한 결과를 나타내었다(Fig. 2). 이는 앞서 언급하였던 monolayer spot assay 결과와 유사하였다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에서는 V. alginolyticus에 특이적인 파아지 VAP11의 기본적인 생물학적 특성을 밝혔으며 이러한 결과들은 각종 박테리아성 질병의 예방 및 치료를 위한 항생제 대체제로서 숙주균 특이 파아지 개발을 위해 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- alginolyticus의 특정한 lipopolysaccharide (LPS)와 outer membrane proteins (OMPs)가 파아지의 감염을 저해 시키는 인자로 작용 할 수도 있을 것으로 추정된다. 만약 그렇다면 파아지에 대한 내성균주가 어떻게 생성될 수도 있는 지 정확한 메커니즘을 조사하기 위해는 추가적인 실험이 요구된다. 파아지의 역가를 측정한 결과 5배에서 20배 희석 시까지 파아지가 첨가된 샘플은 숙주 균이 모두 사멸되어 균이 검출 되지 않았으며 25 및 50배 샘플의 경우에는 대조군에 비하여 감소는 되는 듯하였으나 2시간 이후부터 균이 모두 증식하여 대조군과 비슷한 결과를 나타내었다(Fig.
- 이러한 결과는 앞서 실험된 monolayer spot의 결과와 유사한 현상이라 생각된다. 숙주균과 파아지에 관련된 내성 메커니즘의 연구는 더 진행되어야 할 것으로 생각되며 추후 숙주균을 사멸시킬 수 있는 파아지의 적정농도를 적용한다면 숙주균에 대한 파아지의 최적 사멸 효과를 볼 수 있을 것으로 기대 한다.
- alginolyticus를 서해안 양식장의 해수와 어패류로부터 분리 동정 하였으며 이에 대한 특이적인 파아지를 분리하여 그에 대한 생물학적 특성을 조사하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 Vibrio 질병에 대한 예방 및 치료 대책의 가능성이 수월해 질 것으로 생각된다.
- 그 이유로는 용균성 파아지의 복제과정 중 일부의 박테리아가 살아남아 파아지 감염에 대한 박테리아의 내성이 발생되었을 가능성을 들 수 있다. 이러한 현상에 대한 자세한 기전은 더욱 연구가 진행되어야 하겠지만 V. alginolyticus의 특정한 lipopolysaccharide (LPS)와 outer membrane proteins (OMPs)가 파아지의 감염을 저해 시키는 인자로 작용 할 수도 있을 것으로 추정된다. 만약 그렇다면 파아지에 대한 내성균주가 어떻게 생성될 수도 있는 지 정확한 메커니즘을 조사하기 위해는 추가적인 실험이 요구된다.
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