비알코올성 지방간 세포 모델에 대한 택사, 산사, 구기자, 울금, 단삼, 인진의 효능 비교 Comparison of the Therapeutic Efficacy of Rhizoma Alismatis, Fructus Crataegi, Fructus Lycii, Radix Curcumae, Radix Salviae Miltiorrhizae, Herba Artemisiae Scopariae on the Experimental Cellular Model of Nonalcoholic Fatty Liver Disease원문보기
Objectives : We try to compared the efficacy of six herbal medicines, Rhizoma Alismatis (RA), Fructus Crataegi (FC), Fructus Lycii (FL), Radix Curcumae (RC), Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM), and Herba Artemisiae Scopariae (HAS), constituting KHchunggan-tang which was previously proven to be hepato...
Objectives : We try to compared the efficacy of six herbal medicines, Rhizoma Alismatis (RA), Fructus Crataegi (FC), Fructus Lycii (FL), Radix Curcumae (RC), Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM), and Herba Artemisiae Scopariae (HAS), constituting KHchunggan-tang which was previously proven to be hepatoprotective on non-alcoholic fatty liver disease with combined properties of cellular steatosis, ROS production, and cytoprotection. Methods : HepG2 cells were pretreated with aqueous extracts of the six herb medicines at concentrations of 1, 10, 50 and 100 ${\mu}g/ml$ each, and treated with 0.5 mM palmitate consecutively. After 21 hrs, cell viability was assessed using MTT assay, and the percentage of cells with sub-G1 DNA content was measured using fluorescence-activated cell sorting after propidium iodide staining. Results : The first three extracts, RA, FC, and FL restored cell viability reduced by palmitate in MTT assay, and RA, FC, FL and RC inhibited palmitate-induced apoptosis in sub-G1 analysis. FL showed relatively weak potential only at tested maximal dose, and RA showed the greatest higher efficacy on this experimental cellular model of nonalcoholic fatty liver disease. Conclusions : According to this comparative experiment, Rhizoma Alismatis seems to have the most powerful potential among the six herbs constituting KHchunggan-tang, and consecutive further study seems to be required for more standardized and effective clinical application of KHchunggan-tang for treatment of non-alcoholic fatty liver disease.
Objectives : We try to compared the efficacy of six herbal medicines, Rhizoma Alismatis (RA), Fructus Crataegi (FC), Fructus Lycii (FL), Radix Curcumae (RC), Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM), and Herba Artemisiae Scopariae (HAS), constituting KHchunggan-tang which was previously proven to be hepatoprotective on non-alcoholic fatty liver disease with combined properties of cellular steatosis, ROS production, and cytoprotection. Methods : HepG2 cells were pretreated with aqueous extracts of the six herb medicines at concentrations of 1, 10, 50 and 100 ${\mu}g/ml$ each, and treated with 0.5 mM palmitate consecutively. After 21 hrs, cell viability was assessed using MTT assay, and the percentage of cells with sub-G1 DNA content was measured using fluorescence-activated cell sorting after propidium iodide staining. Results : The first three extracts, RA, FC, and FL restored cell viability reduced by palmitate in MTT assay, and RA, FC, FL and RC inhibited palmitate-induced apoptosis in sub-G1 analysis. FL showed relatively weak potential only at tested maximal dose, and RA showed the greatest higher efficacy on this experimental cellular model of nonalcoholic fatty liver disease. Conclusions : According to this comparative experiment, Rhizoma Alismatis seems to have the most powerful potential among the six herbs constituting KHchunggan-tang, and consecutive further study seems to be required for more standardized and effective clinical application of KHchunggan-tang for treatment of non-alcoholic fatty liver disease.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 개별 구성 한약재의 비알코올성 지방간 질환에 대한 효능을 직접적으로 비교해보고자 HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 비알코올성 지방간 세포 모델에 개별 한약재 추출물을 처리하여 지방산에 의한 세포 활성도 저하와 apoptosis에 미치는 영향을 관찰하였다. 지방산에 의해 저하된 세포 활성도를 회복시키고 apoptosis를 억제시키는 효능은 택사 추출물에서 가장 뚜렷 하게 관찰되었다.
이에 저자는 KH청간탕을 구성하는 택사, 산사, 구기자, 울금, 단삼, 인진에 대한 기존 연구를 조사하여 이들 약재들이 모두 비알코올성 지방간 질환을 개선시키는 효능이 있거나, 비만 및 고지혈증을 완화시키고 혈당을 낮추는 등의 대사증후군을 개선시키는 효능이 있음을 확인하였고, 따라서 본 연구에서는 일정 정도의 약리 작용을 가진 것으로 확인된 이들 한약재들의 상대적 약효 차이를 비교 측정해보기 위해 실험적으로 유도한 비알코올성 지방간 세포 모델에 개별 한약재 추출물을 처리하여 lipotoxicity와 lipoapoptosis에 미치는 영향을 관찰하고 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
0)을 처리하고 실온에서 차광 상태로 30분간 두었다. FACSCalibur flow cytometer(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)를 이용하여 세포 주기 상태를 분석하였다. 각 측정 조건마다 최소 20,000개 이상의 세포를 분석하였다.
HepG2 세포를 60 mm dish에 배양하여 80% confluence 상태가 되면, 1시간 전 각각의 한약재 추출물을 투약하고, palmitate 0.5 mM로 21 시간 처리하였다. Ice-cold phosphate-buffered saline(PBS)로 세척 후, 세포를 고정하기 위해 70%(v/v) ethanol에서 4 ℃ 냉장 상태로 하룻밤 처리하였다.
MTT assay를 통해 세포 활성도를 측정하였다. 먼저 HepG2 cell을 24-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 seeding하였다.
Palmitate를 isopropanol에 50 mM 농도가 되도록 녹인 다음, HepG2 cell에 처리할 때는 배양액에 대하여 0.5 mM(1%) 농도가 되도록 투약하였다. 배양액은 1 % bovine serum albumin(BSA)를 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용하였다.
구기자 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상 및 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 구기자 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음 택사 및 산사 물 추출물을 테스트한 방법과 동일한 방법으로 MTT assay와 Sub-G1 analysis를 시행하였다. 구기자 물 추출물은 100 μg/ml로 투여된 경우에만 palmitate에 의해 저하된 세포 활성도를 증가시키고 증가한 sub-G1부분을 감소시키는 효과를 나타냈다(Fig.
다음 날, 각각의 한약재 추출물(1, 10, 50, 100 μg/ml)과 palmitate(0.5 mM)를 1시간의 간격을 투고 투약한 다음 21시간 동안 배양하였다.
단삼 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상 및 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, 상기한 시료들과 동일한 조건 및 동일한 방법으로 MTT assay와 Sub-G1 analysis를 시행하였다. 단삼물 추출물은 palmitate에 의해 저하된 세포 활성도를 증가시키지 못했고, 증가한 sub-G1을 감소시키는 효과도 나타나지 않았다(Fig.
산사 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 산사 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음 MTT assay를 통해 HepG2 세포의 세포 활성도를 측정한 결과, palmitate에 의해 세포 활성도가 뚜렷이 감소하는 것을 확인하였으며, 산사 물 추출물이 10 μg/ml 이상의 농도로 투여된 경우 이러한 세포 활성도의 저하가 일부 회복되는 경향을 관찰하였다 (Fig. 2A).
울금 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상 및 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 울금 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음 상기한 시료들과 동일한 방법으로 MTT assay와 Sub-G1 analysis를 시행하였다. 울금 물 추출물은 palmitate에 의해 증가한 sub-G1부분을 감소시키는 효과는 있었으나, 저하된 세포 활성도를 증가시키지 못했고, 오히려 세포 활성도를 더욱 저하시키는 결과가 관찰되었다(Fig.
인진 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상 및 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, 상기한 시료들과 동일한 조건 및 동일한 방법으로 MTT assay와 Sub-G1 analysis를 시행하였다. 인진물 추출물도 단삼 물 추출물과 같이 palmitate에 의해 저하된 세포 활성도를 증가시키지 못했고, 증가한 sub-G1을 감소시키지 못했다(Fig.
택사 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 세포 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 택사 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음 MTT assay를 통해 HepG2 세포의 세포 활성도를 측정한 결과, palmitate에 의해 세포 활성도가 뚜렷이 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 세포 활성도의 저하가 택사 물 추출물에 의해 용량 의존적으로 회복되는 경향을 관찰하였다(Fig. 1A). 택사 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 위와 같이 택사 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음, Sub-G1 부분을 측정한 결과, palmitate 에 의해 sub-G1 부분이 증가하였으며, 택사 물 추출물을 전처리하였을 때 sub-G1 부분의 증가가 농도 의존적으로 억제되었다(Fig.
대상 데이터
Human hepatocellular carcinoma cell line인 HepG2 cell을 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml 및 fetal bovine serum(FBS) 10%을 포함한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 배양액으로 사용하고, 37 ℃, CO2 5% 로 설정된 incubator에서 배양하였다.
FACSCalibur flow cytometer(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)를 이용하여 세포 주기 상태를 분석하였다. 각 측정 조건마다 최소 20,000개 이상의 세포를 분석하였다.
본 실험에서는 KH청간탕을 구성하는 한약재 중 택사(tuber of Alisma orientale Juzepzuk), 산사(ripe fruit of Crataegus pinnatifida Bunge), 구기자(ripe fruit of Lycium barbarum Linné), 울금 (root tuber of Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling), 단삼(root of Salvia miltiorrhiza Bunge), 인진(aerial part of Artemisia capillaris Thunberg)을 대한약전 및 대한약전외 한약규격집에 근거하여 경희대 부속 한방병원에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
One-way analysis of variance(ANOVA) test 로 그룹 간의 측정값을 비교하였고, Turkey test로 사후분석을 시행하였다. 모든 검정에서 P＜0.
PASW Statistics Data Editor v18 Korean (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하였고, 모든 측정값은 평균(mean)±표준오차(SEM)로 표시하였다.
성능/효과
구기자 물 추출물은 100 μg/ml로 투여된 경우에만 palmitate에 의해 저하된 세포 활성도를 증가시키고 증가한 sub-G1부분을 감소시키는 효과를 나타냈다(Fig. 3).
2A). 산사 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 위와 같이 산사 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음, Sub G1 부분을 측정한 결과, palmitate에 의해 sub-G1 부분이 증가하였으며, 산사 물 추출물을 전처리하였을 때 sub-G1 부분의 증가가 부분적으로 억제되었다(Fig. 2B).
산사 추출물에서도 유사한 효과가 관찰되었으며, 구기자 추출물은 본 실험에서 사용된 가장 높은 농도인 100 μg/ml에서만 효능이 관찰되었다.
analysis를 시행하였다. 울금 물 추출물은 palmitate에 의해 증가한 sub-G1부분을 감소시키는 효과는 있었으나, 저하된 세포 활성도를 증가시키지 못했고, 오히려 세포 활성도를 더욱 저하시키는 결과가 관찰되었다(Fig. 4).
인진, 택사, 산사, 구기자, 울금, 단삼 추출물 중에서 택사, 산사 및 구기자 추출물에서 plamitate에 의한 lipotoxicity와 lipoapoptosis 완화 효과가 관찰되었고, 택사 추출물에서 그 효능이 가장 뚜렷하게 관찰되었다. 향후 추가적 연구가 더 진행된다면 한방 임상에서 비알코올성 지방간질환에 대한 처방 구성과 표준화에 일정 정도 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
따라서 본 연구에서는 개별 구성 한약재의 비알코올성 지방간 질환에 대한 효능을 직접적으로 비교해보고자 HepG2 cell에 palmitate를 처리하여 유도한 비알코올성 지방간 세포 모델에 개별 한약재 추출물을 처리하여 지방산에 의한 세포 활성도 저하와 apoptosis에 미치는 영향을 관찰하였다. 지방산에 의해 저하된 세포 활성도를 회복시키고 apoptosis를 억제시키는 효능은 택사 추출물에서 가장 뚜렷 하게 관찰되었다. 산사 추출물에서도 유사한 효과가 관찰되었으며, 구기자 추출물은 본 실험에서 사용된 가장 높은 농도인 100 μg/ml에서만 효능이 관찰되었다.
1A). 택사 물 추출물이 지방산에 의해 유발된 apoptosis에 미치는 영향을 평가하기 위해, HepG2 cell에 위와 같이 택사 물 추출물과 palmitate를 처리하고 배양한 다음, Sub-G1 부분을 측정한 결과, palmitate 에 의해 sub-G1 부분이 증가하였으며, 택사 물 추출물을 전처리하였을 때 sub-G1 부분의 증가가 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 1B).
후속연구
단삼과 인진 추출물은 100 μg/ml 이하의 농도에서는 lipotoxicity를 완화시키거나 lipoapoptosis를 억제시키는 효능을 나타내지 않았다. 다만, 본 연구에서 사용한 실험 방법은 많이 사용되고 있는 모델의 하나일 뿐이며 다른 방법으로 비교할 경우또 다른 결과가 관찰될 가능성이 있으므로, 약재간 효능 비교에 대한 보다 정확한 정보를 얻기 위해서는 더 다양한 방법을 통한 검증이 향후 필요할 것으로 생각된다.
인진, 택사, 산사, 구기자, 울금, 단삼 추출물 중에서 택사, 산사 및 구기자 추출물에서 plamitate에 의한 lipotoxicity와 lipoapoptosis 완화 효과가 관찰되었고, 택사 추출물에서 그 효능이 가장 뚜렷하게 관찰되었다. 향후 추가적 연구가 더 진행된다면 한방 임상에서 비알코올성 지방간질환에 대한 처방 구성과 표준화에 일정 정도 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
우리나라의 비알코올성 지방간질환 성인 유병률은 어느정도인가?
비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 대사증후군의 한 형태로 중성지방이 간세포 내에 미만성으로 침윤한 경우를 말하며, 단순 지방증(simple steatosis) 소견만을 나타내기도 하지만, 지방간염(steatohepatitis) 및 간경변증으로 까지 진행하기도 한다2. 국내 유병률은 성인의 18%까지 보고되고 있으며, 비만인구의 증가와 함께 향후 만성 간질환의 원인에서 보다 큰 부분을 차지할 것으로 생각된다3.
대사증후군이란 무엇인가?
대사증후군이란 각종 심혈관 질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로서, 비만, 고지혈증, 인슐린 저항성 등을 특징으로 한다1. 비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 대사증후군의 한 형태로 중성지방이 간세포 내에 미만성으로 침윤한 경우를 말하며, 단순 지방증(simple steatosis) 소견만을 나타내기도 하지만, 지방간염(steatohepatitis) 및 간경변증으로 까지 진행하기도 한다2.
비알코올성 지방간질환이란 무엇인가?
대사증후군이란 각종 심혈관 질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로서, 비만, 고지혈증, 인슐린 저항성 등을 특징으로 한다1. 비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 대사증후군의 한 형태로 중성지방이 간세포 내에 미만성으로 침윤한 경우를 말하며, 단순 지방증(simple steatosis) 소견만을 나타내기도 하지만, 지방간염(steatohepatitis) 및 간경변증으로 까지 진행하기도 한다2. 국내 유병률은 성인의 18%까지 보고되고 있으며, 비만인구의 증가와 함께 향후 만성 간질환의 원인에서 보다 큰 부분을 차지할 것으로 생각된다3.
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