비알코올성 지방간 세포 모델에서 곤포의 효능과 기전 연구 Research on Anti-lipogenic Effect and Underlying Mechanism of Laminaria japonica on Experimental Cellular Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease원문보기
Objectives : We tried to uncover the anti-lipogenic effect and underlying mechanism of Laminaria japonica on an experimental cellular model of non-alcoholic fatty liver disease. Methods : Ethanol extract of Laminaria japonica (LJ) was prepared. Intracellular lipid content of palmitate-treated HepG2 ...
Objectives : We tried to uncover the anti-lipogenic effect and underlying mechanism of Laminaria japonica on an experimental cellular model of non-alcoholic fatty liver disease. Methods : Ethanol extract of Laminaria japonica (LJ) was prepared. Intracellular lipid content of palmitate-treated HepG2 cells was evaluated with or without LJ treatment. We measured the effects of LJ on liver X receptor ${\alpha}$ ($LXR{\alpha}$) and sterol regulatory element-binding transcription factor-1c (SREBP-1c) expression, transcription level of lipogenic genes, including acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1), and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) activation in HepG2 cells. Results : LJ markedly attenuated palmitate-induced intracellular lipid accumulation in HepG2 cells. LJ suppressed $LXR{\alpha}$-dependent SREBP-1c activation, and SREBP-1c mediated induction of ACC, FAS, and SCD-1. Furthermore, LJ activated Nrf2, which plays an important cytoprotective role in non-alcoholic fatty liver disease. Conclusions : Our study suggests that LJ has the potential to alleviate hepatic lipid accumulation, and this effect was mediated by inhibiting the $LXR{\alpha}$-SREBP-1c pathway that leads to hepatic steatosis. In addition, the anti-lipogenic potential may, at least in part, be associated with activation of Nrf2.
Objectives : We tried to uncover the anti-lipogenic effect and underlying mechanism of Laminaria japonica on an experimental cellular model of non-alcoholic fatty liver disease. Methods : Ethanol extract of Laminaria japonica (LJ) was prepared. Intracellular lipid content of palmitate-treated HepG2 cells was evaluated with or without LJ treatment. We measured the effects of LJ on liver X receptor ${\alpha}$ ($LXR{\alpha}$) and sterol regulatory element-binding transcription factor-1c (SREBP-1c) expression, transcription level of lipogenic genes, including acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1), and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) activation in HepG2 cells. Results : LJ markedly attenuated palmitate-induced intracellular lipid accumulation in HepG2 cells. LJ suppressed $LXR{\alpha}$-dependent SREBP-1c activation, and SREBP-1c mediated induction of ACC, FAS, and SCD-1. Furthermore, LJ activated Nrf2, which plays an important cytoprotective role in non-alcoholic fatty liver disease. Conclusions : Our study suggests that LJ has the potential to alleviate hepatic lipid accumulation, and this effect was mediated by inhibiting the $LXR{\alpha}$-SREBP-1c pathway that leads to hepatic steatosis. In addition, the anti-lipogenic potential may, at least in part, be associated with activation of Nrf2.
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문제 정의
본 연구에서는 곤포 추출물의 anti-lipogenic effect가 Nrf2에 의해 매개되는지를 확인해보기 위해, HepG2 cell에 곤포 추출물을 투여하고 Nrf2의 변화를 관찰하였다. 그 결과 곤포 추출물은 Nrf2 발현을 증가시키는 것이 확인되었으며, 따라서 곤포 추출물의 anti-lipogenic effect가 최소한 부분적으로는 Nrf2활성화를 통해 이루어지는 것으로 판단할 수 있다.
이에 저자는 본 연구에서 곤포를 대상으로 비알코올성 지방간 질환에서의 그 효능 및 작용 기전을 확인해 보고자, lipogenesis를 유발하는 주요 신호체계인 LXRα-SREBP-1c pathway8와 비알코올성 지방간 질환의 key regulator로 최근 주목받고 있는 Nrf29에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
HepG2 cell에 T0901317 10 μM을 24처리하였으며, 곤포 투여군에는 마지막 16시간 동안 곤포 추출물을 함께 처리하였다.
HepG2 cell에 palmitate로 지방증을 유도할 때, 곤포 추출물을 함께 투여하며 세포 내 지질 축적의 변화를 관찰하였다. HepG2 cell을 palmitate 0.
HepG2 cell에 지방증(steatosis)을 일으키기 위해 palmitate를 처리하였다. 1% bovine serum albumin 을 함유한 DMEM을 배양액으로 사용하여, palmitate 0.
HepG2 cell에 palmitate로 지방증을 유도할 때, 곤포 추출물을 함께 투여하며 세포 내 지질 축적의 변화를 관찰하였다. HepG2 cell을 palmitate 0.5 mM 함유 배지에서 24시간 배양한 다음, 축적된 세포 내 지방을 Nile Red를 이용하여 염색하였다. 곤포 투여군에는 곤포 추출물 100 μg/ml을 staining 16시간전 처리하였다.
Horseradish peroxidase(HRP) 가 결합되어 있는 2차 항체와 상온에서 1시간 반응 시킨 다음, SuperSignal® chemiluminescence detection kit(Thermo Scientific, IL, USA)로 band를 검출하였다.
Lipogenesis 관련 유전자 발현을 측정하기 위하여 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출한 다음, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다.
MTT assay를 통해 세포 활성도를 측정하였다. 96-well plate에 104 cells/well의 밀도로 HepG2 Cell 을 seeding하였다.
Nuclear protein은 NE-PER™ nuclear extraction kit(Thermo Scientific, IL, USA)로 추출하였다.
paraformaldehyde 4%로 상온에서 15분간 고정한 다음, PBS로 세척하고, Nile Red 100 ng/ml로 상온에서 5분간 세포내 중성 지방을 염색하였다. Olympus FV-1000 confocal laser scanning microscope(Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하고, Image J 1.48 software로 정량화하였다.
Lipogenesis 관련 유전자 발현을 측정하기 위하여 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다. RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출한 다음, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였다.
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출한 다음, M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 1.
Total cell lysate는 Protease inhibitor Cocktail(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% sodium orthovanadate, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS) 로 추출하였다. Nuclear protein은 NE-PER™ nuclear extraction kit(Thermo Scientific, IL, USA)로 추출하였다.
각 well에 MTT 500 μg/ml를 처리하고 4시간 뒤, 세포들이 MTT를 환원하여 생성한 formazan crystal을 측정하기 위해, DMSO를 이용하여 용해한 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
곤포 추출물의 처리 농도는 지질 축적 완화 효과가 뚜렷하게 관찰된 농도(100μg/ml)와 그 보다 낮의 단계의 농도 중 한 농도(50μg/ml)를 임의로 설정하였다.
곤포 추출물이 HepG2 cell에 대하여 세포 독성을 나타내지 않는 안전 농도 범위를 측정하기 위해 농도를 증가시키며 MTT assay를 시행하였다. 곤포 추출물을 10, 50, 100, 500 μg/ml 농도로 처리한 배지에서 HepG2 cell을 16시간 배양한 다음 MTT assay를 시행하였다.
곤포 추출물이 Nrf2 활성화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 HepG2 cell에 곤포 추출물 50, 100 μg/ml를 투여하고 8, 16시간 배양한 다음, Nrf2 protein의 변화를 western blot으로 측정하였다.
다음 날 곤포 에탄올 추출물 10, 50, 100, 500 μg/ml를 투약하고 16시간 배양하였다.
본 실험에서는 LXRα agonist T0901317로 LXRα을 통해, SREBP-1c의 발현을 유도하고, 곤포 추출물 투여 시 LXRα 및 SREBP-1c의 변화를 관찰하였다.
양성 대조군에는 sulforaphane 10 μM을 처리하였다.
HepG2 cell에 T0901317을 처리하면 SREBP-1c이 발현되면서 ACC, FAS, SCD-1 mRNA 또한 증가한다. 위에서 기술한 것과 동일한 방법으로 HepG2 cell에 T0901317과 곤포 추출물을 처리하였다. 곤포 추출물을 함께 처리할 경우 T0901317에 의한 ACC, FAS, SCD-1 mRNA의 발현이 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig.
TaqPCRx DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 1.2% agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide으로 염색 후 자외선으로 band를 확인하였다.
대상 데이터
HepG2 cell은 human hepatocellular carcinoma cell 기원 세포로서 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 및 10% heatinactivated fetal bovine serum을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 이용하여, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
곤포는 ㈜옴니허브로부터 구매하여 사용하였다. 제분기로 분쇄하여 파우더로 만든 곤포 200 g을 에탄올 600 ml에 담그고, 60 ℃에서 8시간 동안 추출후 용매를 분리 여과하였다.
데이터처리
Student’s t-test와 One-way analysis of variance(ANOVA) test 로 그룹 간 평균을 비교하여, P＜0.05인 경우 통계 적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다.
그래프에서 각각의 측정값은 평균±표준오차로 나타내었다.
성능/효과
곤포 추출물을 투여한 세포에서는 T0901317에 의한 LXRα mRNA 발현 증가가 억제되었으며, 결과적으로 SREBP-1c mRNA 및 protein의 발현도 유의하게 억제되었다(Fig. 3).
위에서 기술한 것과 동일한 방법으로 HepG2 cell에 T0901317과 곤포 추출물을 처리하였다. 곤포 추출물을 함께 처리할 경우 T0901317에 의한 ACC, FAS, SCD-1 mRNA의 발현이 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
본 연구에서는 곤포 추출물의 anti-lipogenic effect가 Nrf2에 의해 매개되는지를 확인해보기 위해, HepG2 cell에 곤포 추출물을 투여하고 Nrf2의 변화를 관찰하였다. 그 결과 곤포 추출물은 Nrf2 발현을 증가시키는 것이 확인되었으며, 따라서 곤포 추출물의 anti-lipogenic effect가 최소한 부분적으로는 Nrf2활성화를 통해 이루어지는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 Nrf2는 발병 초기 단계인 지질 축적에서부터, 핵심 병리 기전인 산화적 스트레스 발생, 이에 수반하는 염증과 섬유화 단계에 이르기까지 복합적으로 작용하기 때문에 곤포 추출물은 기존의 비알코올성 지방간 치료제에 비하여 보다 효과적인 약리 활성을 가질 것으로 추정되며 향후 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
본 실험에서는 HepG2 cell에 LXRα agonist T0901317을 처리하여 SREBP-1c를 증가시킴으로써, ACC, FAS, SCD-1의 발현을 유도하였는데, T0901317과 함께 곤포 추출물을 처리한 경우에는 T0901317에 의한 SREBP-1c와 ACC, FAS, SCD-1의 발현이 억제되었다.
≪東醫寶鑑(外形篇卷三⋅肉)≫에는 “하기(下氣) 작용이 있어, 오래 섭취하면 체중을 감량해주며, 국이나 무침으로 자주 섭취하는 것이 좋다”라고 기록되어 있고7, 현대 연구를 통해서도 비만14,15, 당뇨16,17, 고지혈증18,19에 대한 효능이 밝혀져 있다. 본 연구에서는 palmitate에 의해 증가한 세포 내 지질량이 곤포 추출물에 의해 유의하게 감소하는 것을 확인하여, 곤포가 비알코올성 지방간 질환에서 지방증을 완화 시키는 효능이 있음을 확인하였다.
이상의 결과를 요약하면, 곤포 추출물은 palmitate 로 유도한 비알코올성 지방간 질환 세포 모델에서 지방증을 완화시키는 효능을 나타내며, 이러한 효능은 LXRα-SREBP-1c pathway을 통한 지질 합성 효소들의 발현을 저해함으로써 나타나는 것으로 생각된다.
후속연구
그 결과 곤포 추출물은 Nrf2 발현을 증가시키는 것이 확인되었으며, 따라서 곤포 추출물의 anti-lipogenic effect가 최소한 부분적으로는 Nrf2활성화를 통해 이루어지는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 Nrf2는 발병 초기 단계인 지질 축적에서부터, 핵심 병리 기전인 산화적 스트레스 발생, 이에 수반하는 염증과 섬유화 단계에 이르기까지 복합적으로 작용하기 때문에 곤포 추출물은 기존의 비알코올성 지방간 치료제에 비하여 보다 효과적인 약리 활성을 가질 것으로 추정되며 향후 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이상의 결과를 요약하면, 곤포 추출물은 palmitate 로 유도한 비알코올성 지방간 질환 세포 모델에서 지방증을 완화시키는 효능을 나타내며, 이러한 효능은 LXRα-SREBP-1c pathway을 통한 지질 합성 효소들의 발현을 저해함으로써 나타나는 것으로 생각된다. 또한, 이러한 효능이 최소한 부분적으로는 Nrf2를 통해 매개될 것으로 생각되며, Nrf2는 다양한 cytoprotective response에 관여하므로 곤포의 간세포 보호 작용에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
지방간이란?
지방간이란 간조직에 지방이 과다 축적되어 간 무게의 5% 이상을 차지하는 경우를 말하여, 지방 섭취 증가, 간 내 지방 축척 및 합성 증가, 또는 간에서의 지방 배출이 감소하는 하는 경우 발생하게 된다1. 지방간의 주요 원인은 비만, 2형 당뇨, 이상지질혈증(dyslipidemia), 과도한 음주, 일부 약물, C형 간염, Wilson’s disease 등이 있으며, 이 중에서 음주, 약물이나 특정 질환에 의해 속발하는 경우, 또는 선천적 대사 장애 등에 의한 경우는 제외하고, 비만, 2형 당뇨, 이상지질혈증 등의 대사 이상 상태에 의해 발생한 경우를 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)이라고 한다2.
지방간이 발생하는 원인은 무엇인가?
지방간이란 간조직에 지방이 과다 축적되어 간 무게의 5% 이상을 차지하는 경우를 말하여, 지방 섭취 증가, 간 내 지방 축척 및 합성 증가, 또는 간에서의 지방 배출이 감소하는 하는 경우 발생하게 된다1. 지방간의 주요 원인은 비만, 2형 당뇨, 이상지질혈증(dyslipidemia), 과도한 음주, 일부 약물, C형 간염, Wilson’s disease 등이 있으며, 이 중에서 음주, 약물이나 특정 질환에 의해 속발하는 경우, 또는 선천적 대사 장애 등에 의한 경우는 제외하고, 비만, 2형 당뇨, 이상지질혈증 등의 대사 이상 상태에 의해 발생한 경우를 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)이라고 한다2.
비알코올성 지방간 질환의 발병 과정은 어떻게 되는가?
비알코올성 지방간 질환은 발병 과정은 복잡한 다단계의 반응으로 구성된다. 처음에는 비만, 당뇨, 고질혈증 등으로 인해 insuline resistance가 유발되고 이로 인해 간내 지질 축적이 증가한다. 증가한 지방산은 mitochondria, peroxisome 및 endoplasmic reticulum에서 대사 과정을 거치며 산화적 스트레스를 유발한다. 증가한 산화적 스트레스는 ATP 및 NAD 고갈, DNA 손상, 각종 단백과 세포막 손상을 유발하고, kuffer cell을 활성화시켜 각 종 inflammatory cytokines를 증가키시며, stellate cell을 활성화시켜 fibrosis를 유발한다12.
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