미역 물 추출물의 염증 억제 활성을 알아보기 위하여 nitric oxide(NO) 분비량, tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), interleukin-6 (IL-6) 및 IL-$1{\beta}$cytokine 분비량, RAW 264.7 세포의 증식능을 측정하였다. Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 대식세포의 NO 분비능에 미치는 미역 물 추출물의 영향을 알아보기 위해 대식세포 배양액의 $NO_2{^-}$ 농도를 측정한 결과 NO 분비량이 미역 추출물 농도에 의존적으로 유의적인 감소 경향을 나타내는 것을 확인하였으며, 모든 첨가 농도에서 TNF-${\alpha}$, IL-6 및 IL-$1{\beta}$ cytokine 분비량이 감소하는 것을 확인하였다. 특히 IL-6 cytokine의 경우 첨가물 농도에 의존적으로 유의적인 감소를 보였다. 미역 물 추출물 첨가에 의한 TNF-${\alpha}$, IL-6 및 IL-$1{\beta}$ cytokine 및 NO 분비량의 감소가 세포 사멸에 의한 영향인지를 알아보기 위해 마우스 복강 대식세포에 대하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 그 결과 모든 첨가 농도에서 대식세포 증식능이 control에 비해 유의적으로 증가하였다. 따라서 미역 물추출물은 세포사멸에 의해 cytokine 분비량이 감소한 것이 아님을 확인하였으며, 대식세포 증식능을 증가시켜 면역세포를 활성화 시키는 것으로 사료되어진다.
미역 물 추출물의 염증 억제 활성을 알아보기 위하여 nitric oxide(NO) 분비량, tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), interleukin-6 (IL-6) 및 IL-$1{\beta}$ cytokine 분비량, RAW 264.7 세포의 증식능을 측정하였다. Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 대식세포의 NO 분비능에 미치는 미역 물 추출물의 영향을 알아보기 위해 대식세포 배양액의 $NO_2{^-}$ 농도를 측정한 결과 NO 분비량이 미역 추출물 농도에 의존적으로 유의적인 감소 경향을 나타내는 것을 확인하였으며, 모든 첨가 농도에서 TNF-${\alpha}$, IL-6 및 IL-$1{\beta}$ cytokine 분비량이 감소하는 것을 확인하였다. 특히 IL-6 cytokine의 경우 첨가물 농도에 의존적으로 유의적인 감소를 보였다. 미역 물 추출물 첨가에 의한 TNF-${\alpha}$, IL-6 및 IL-$1{\beta}$ cytokine 및 NO 분비량의 감소가 세포 사멸에 의한 영향인지를 알아보기 위해 마우스 복강 대식세포에 대하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 그 결과 모든 첨가 농도에서 대식세포 증식능이 control에 비해 유의적으로 증가하였다. 따라서 미역 물추출물은 세포사멸에 의해 cytokine 분비량이 감소한 것이 아님을 확인하였으며, 대식세포 증식능을 증가시켜 면역세포를 활성화 시키는 것으로 사료되어진다.
The anti-inflammatory effects of Undaria pinnatifida water extract (UPWE) were investigated using lipopolysaccharide-induced inflammatory response in this study. To examine the potential anti-inflammatory properties of UPWE, the cell proliferation, nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), tumor necr...
The anti-inflammatory effects of Undaria pinnatifida water extract (UPWE) were investigated using lipopolysaccharide-induced inflammatory response in this study. To examine the potential anti-inflammatory properties of UPWE, the cell proliferation, nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$) and IL-$1{\beta}$ were measured. As a result, there was no cytotoxicity in the macrophage proliferation treated with UPWE compared to the control. NO levels decreased with increasing concentration of UPWE. Moreover, the secretion of IL-6, TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ were suppressed in a dose-dependent manner, and IL-6 inhibition activities were over 50% at 0.1%. These results suggested that UPWE may have significant effects on inflammatory factors and be a potential anti-inflammatory therapeutic materials.
The anti-inflammatory effects of Undaria pinnatifida water extract (UPWE) were investigated using lipopolysaccharide-induced inflammatory response in this study. To examine the potential anti-inflammatory properties of UPWE, the cell proliferation, nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$) and IL-$1{\beta}$ were measured. As a result, there was no cytotoxicity in the macrophage proliferation treated with UPWE compared to the control. NO levels decreased with increasing concentration of UPWE. Moreover, the secretion of IL-6, TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ were suppressed in a dose-dependent manner, and IL-6 inhibition activities were over 50% at 0.1%. These results suggested that UPWE may have significant effects on inflammatory factors and be a potential anti-inflammatory therapeutic materials.
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문제 정의
Fucoidan은 항암, 항콜레스테롤, 혈액응고 저해, 혈압조절 등의 혈류개선 작용이 우수하며, 지질대사 개선에도 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다(Murata 등, 1999; Bojakowski 등, 2001; Maeda 등, 2005). 이에 본 연구에서는 미역 물 추출물을 이용하여 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 염증 매개물질들의 생성 억제 효과를 관찰함으로써, 항염증 활성을 갖는 기능성 소재로의 가능성을 밝히고자 연구하였다.
제안 방법
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
RAW 264.7 cell 1×105cells/mL를 well plate에 분주하고 20시간 전 배양 후, 1 µg/mL의 LPS와 미역 물 추출물을 농도별(0.001, 0.01, 0.1, 1, 2%)로 첨가하여 37°C, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 24시간 배양하였다.
)하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 각 well에 DMSO를 첨가하고 이를 microplate reader (Model 550, Bio-rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(obtical density(O.D))를 측정하였다. 세포 증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.
NO는 NO 합성효소에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 신경전달과 혈관확장, 면역반응 등 생리적인 기능을 조절하는 중요한 역할을 하지만, LPS 및 염증성 cytokine에 의해 생성된 iNOS는 다량의 NO를 생성하고 과발현된 NO는 혈관 투과성, 부종 그리고 염증을 심화시켜 조직을 손상시키고 암으로의 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Jeong 등, 2012; Kim 등, 2012; Lee 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS로 염증반응을 유도시키고 미역 물 추출물을 농도별로 처리하여 생성된 NO 생성량을 griess 시약을 이용하여 측정하였다. LPS 처리 후 NO 생성량은 정상세포 12.
먼저, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) microplate에 anti-mouse IL-6, TNF-α 및 IL-1β mAb를 분주하여 하룻밤 동안 coating시켰다.
미역 물 추출물 첨가에 의한 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 및 NO 분비량의 감소가 세포 사멸에 의한 영향인지를 알아보기 위해 마우스 복강 대식세포에 대하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다.
미역 물 추출물의 염증 억제 활성을 알아보기 위하여 nitric oxide (NO) 분비량, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) 및 IL-1β cytokine 분비량, RAW 264.7 세포의 증식능을 측정하였다.
1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, microplate reader (Model 550, Bio-rad)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
세포배양액 내의 IL-6, TNF-α 및 IL-1β cytokine의 분비량을 ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용하여 측정하였다.
세포에 1 µg/mL의 LPS와 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 2%의 미역 물 추출물을 처리하여 24시간 재배양하였다.
대상 데이터
Murine의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB 40071)에서 분양받아 사용하였으며, DMEM에 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin 을 첨가한 배지를 배양액으로 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 미역은 부산 인근해에서 채취한 것으로 담수로 깨끗이 수세하고 동결 건조한 후, 이를 분말화하고 진공 포장하여 −20°C에서 저장하며 사용하였다.
실험과정의 모든 세포는 80–90% 정도의 밀도로 자랐을때 계대 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
데이터처리
모든 실험에 대한 통계 처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 one way ANOVA법으로 분산분석을 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 Duncan의 다중검정법으로 p<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
또한 TNF-α와 더불어 염증에 중요한 작용을 하는 전 염증성 매개 물질에 속한다(Bhattacharyya 등, 2002). RAW 264.7 세포에서 미역 물 추출물이 염증을 일으키는 cytokine 중 하나로 알려진 IL-6의 형성을 억제하는지 알아보기 위해, RAW 264 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물을 농도별로 처리한 후 분비된 IL-6 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 그 결과 정상군의 IL-6 분비량은 전혀 없었고, 미역 물 추출물에 의한 IL-6 분비량은 미역 물 추출물 0.
미역 물 추출물이 염증성 cytokine인 IL-1β의 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물과 농도별 병행 처리한 후 분비된 TNF-α 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다.
미역 물 추출물이 염증성 cytokine인 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물과 농도별 병행 처리한 후 분비된 TNF-α 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다.
시료의 세포독성을 평가하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 대식세포의 NO 분비능에 미치는 미역 물 추출물의 영향을 알아보기 위해 대식세포 배양액의 NO2− 농도를 측정한 결과 NO분비량이 미역 추출물 농도에 의존적으로 유의적인 감소 경향을 나타내는 것을 확인하였으며, 모든 첨가 농도에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 분비량이 감소하는 것을 확인하였다.
미역 물 추출물 첨가에 의한 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 및 NO 분비량의 감소가 세포 사멸에 의한 영향인지를 알아보기 위해 마우스 복강 대식세포에 대하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 그 결과 모든 첨가 농도에서 대식세포 증식능이 control에 비해 유의적으로 증가하였다. 따라서 미역 물 추출물은 세포사멸에 의해 cytokine 분비량이 감소한 것이 아님을 확인하였으며, 대식세포 증식능을 증가시켜 면역세포를 활성화 시키는 것으로 사료되어진다.
7 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물과 농도별 병행 처리한 후 분비된 TNF-α 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 그 결과 미역 물 추출물 0.01% 이상의 농도에서 무처리에 비하여 유의적으로 감소된 결과를 보였다(Fig. 5).
7 세포에서 미역 물 추출물이 염증을 일으키는 cytokine 중 하나로 알려진 IL-6의 형성을 억제하는지 알아보기 위해, RAW 264 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물을 농도별로 처리한 후 분비된 IL-6 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 그 결과 정상군의 IL-6 분비량은 전혀 없었고, 미역 물 추출물에 의한 IL-6 분비량은 미역 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2% 처리시 LPS 단독 처리에 비해 약 18, 39, 46, 52, 59%의 높은 감소 효과를 보여 RAW 264.7 세포의 IL-6 분비 억제에 효과를 가지는 것을 확인하였다(Fig. 3). 이는 오공 물 추출물이 대식세포의 IL-6 발현을 농도 의존적으로 유의하게 억제한다는 연구결과(Jo 등, 2011) 와 유사한 경향을 보였다.
7 세포에 LPS 단독처리 혹은 미역 물 추출물과 농도별 병행 처리한 후 분비된 TNF-α 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 그 결과, 각 첨가 농도에서(0.001, 0.01, 0.1, 1, 2%) 농도 의존적으로 유의적인 분비량 감소를 보였다(Fig. 4). 이를 통해 미역이 항염증 기능성 물질로의 가능성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
그 결과 모든 첨가 농도에서 대식세포 증식능이 control에 비해 유의적으로 증가하였다. 따라서 미역 물 추출물은 세포사멸에 의해 cytokine 분비량이 감소한 것이 아님을 확인하였으며, 대식세포 증식능을 증가시켜 면역세포를 활성화 시키는 것으로 사료되어진다.
7 세포의 증식을 유도하는 것을 관찰하였다. 따라서 미역 물 추출물이 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않으면서 세포 염증성 매개 물질의 생성 억제에 효과적일 것으로 사료된다.
4µM/mL으로 LPS 처리 대조군보다 NO 분비량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 미역 물 추출물이 대식세포의 NO 생성 저해능을 보임을 확인하였다(Fig. 2).
또한 미역 물 추출물을 농도별로(0.001, 0.01, 0.1, 1, 2%) 처리하였을 때 55.9, 51.5, 47.2, 44.9 및 42.4µM/mL으로 LPS 처리 대조군보다 NO 분비량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
7 cell은 염증유발과 관련된 주요 세포로 그람 음성균의 내독소로 알려진 LPS와 같은 외부자극에 의해서 prostaglandins (PGs)나 NO를 포함하는 다양한 염증 유발 인자를 방출하여 병리적인 반응을 일으킨다(Lee 등, 2012). 미역 물 추출물의 대식세포에 대한 세포독성을 알아 보기 위해 MTT assay를 수행한 결과(Fig. 1), 사용된 모든 농도에서(0.001, 0.01, 0.1, 1, 2%) control에 비해 100% 이상의 생존률을(160, 156, 166, 170, 179%) 보여 RAW 264.7 세포의 증식을 유도하는 것을 관찰하였다. 따라서 미역 물 추출물이 RAW 264.
4). 이를 통해 미역이 항염증 기능성 물질로의 가능성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미역에는 어떤 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있는가?
그 중 미역(Undaria pinnatifida)은 다시마목 미역과에 속하는 갈조류로서, 우리나라 전 연안에 분포하며 연해주, 중국, 일본 등 극동지방 특산의 해조류이다(Choi 등, 2008). 미역은 Na, K, Ca, Mg, P, S 등의 무기질, 식이섬유소, 리놀산 및 비타민 등 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있다(Kim과 Kim, 1982; Choi 등, 1992). 특히, 미역에 들어 있는 점질 다당류인 알긴산(alginic acid)은 중금속 및 방사능 물질의 체외배출, 콜레스테롤 저하, 비만 및 변비방지 효능과 더불어 혈압이나 당뇨 예방효과가 높다는 보고가 있다(Kim과 Cheng, 1984; Sato 등, 2002; Suetsuna 등, 2004).
병리적인 원인에 의한 과도한 nitric oxide 형성은 무엇을 일으키는가?
염증 반응이 일어나는 과정 중에 많은 양의 염증 유도 사이토카인(proinflammatory cytokines) 및 nitric oxide (NO)가 생성된다. 일반적인 NO는 박테리아를 죽이거나 종양을 제거하는 중요한 역할을 하지만 병리적인 원인에 의한 과도한 NO 형성은 염증을 유발시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상을 일으킨다(Stuehr 등, 1991). 현재까지 개발되어 이용되고 있는 일부 합성 염증 억제제는 그 효능과 부작용이 확실히 검증되지 않았고, 고가라는 문제점이 있다.
알긴산은 어떤 효과를 갖는가?
미역은 Na, K, Ca, Mg, P, S 등의 무기질, 식이섬유소, 리놀산 및 비타민 등 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있다(Kim과 Kim, 1982; Choi 등, 1992). 특히, 미역에 들어 있는 점질 다당류인 알긴산(alginic acid)은 중금속 및 방사능 물질의 체외배출, 콜레스테롤 저하, 비만 및 변비방지 효능과 더불어 혈압이나 당뇨 예방효과가 높다는 보고가 있다(Kim과 Cheng, 1984; Sato 등, 2002; Suetsuna 등, 2004). Fucoidan은 항암, 항콜레스테롤, 혈액응고 저해, 혈압조절 등의 혈류개선 작용이 우수하며, 지질대사 개선에도 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다(Murata 등, 1999; Bojakowski 등, 2001; Maeda 등, 2005).
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