갑상선 배양세포(FRTL5)에서 ER stress에 의해서 ER chaperone (Bip, ERp29, Calnexin and PDI), ER stress sensor (PERK, ATF6 and Ire1)와 cAMP phosphodiesterase 7A1 (cAMP PDE7A1) 유전자발현이 증가하는 것을 알았다. 세포배양배지에서 A23187을 제거하면 cAMP PDE7A1 유전자발현이 회복되지만, thapsigagin의 경우는 회복되지 않았다. 그리고 A23187과 TSH를 함께 처리한 경우는 아주 강하게 cAMP PDE7A1 유전자의 발현이 억제되었다. 이 같은 결과는 ER stress에 의해서 cAMP PDE7A1 유전자발현이 상승 발현된다는 첫 보고이다.
갑상선 배양세포(FRTL5)에서 ER stress에 의해서 ER chaperone (Bip, ERp29, Calnexin and PDI), ER stress sensor (PERK, ATF6 and Ire1)와 cAMP phosphodiesterase 7A1 (cAMP PDE7A1) 유전자발현이 증가하는 것을 알았다. 세포배양배지에서 A23187을 제거하면 cAMP PDE7A1 유전자발현이 회복되지만, thapsigagin의 경우는 회복되지 않았다. 그리고 A23187과 TSH를 함께 처리한 경우는 아주 강하게 cAMP PDE7A1 유전자의 발현이 억제되었다. 이 같은 결과는 ER stress에 의해서 cAMP PDE7A1 유전자발현이 상승 발현된다는 첫 보고이다.
This study demonstrated that upregulation of gene expression of endoplasmic reticulum (ER) stress chaperones (Bip, ERp29, calnexin, and PDI), ER stress sensors (PERK, ATF6, and Ire1), and cAMP phosphodiesterase 7A1 (cAMP PDE7A1) was induced by ER stresses in FRTL5 cells. While removing A23187 from t...
This study demonstrated that upregulation of gene expression of endoplasmic reticulum (ER) stress chaperones (Bip, ERp29, calnexin, and PDI), ER stress sensors (PERK, ATF6, and Ire1), and cAMP phosphodiesterase 7A1 (cAMP PDE7A1) was induced by ER stresses in FRTL5 cells. While removing A23187 from the culture medium restored upregulation of cAMP PDE7A1 gene expression, removal of thapsigargin did not recover its expression. In addition, cAMP PDE7A1 gene expression was strongly inhibited by treatment with A23187 combined with thyroid stimulating hormone (TSH). The results are the first to show that ER stress induces cAMP PDE7A1 gene expression.
This study demonstrated that upregulation of gene expression of endoplasmic reticulum (ER) stress chaperones (Bip, ERp29, calnexin, and PDI), ER stress sensors (PERK, ATF6, and Ire1), and cAMP phosphodiesterase 7A1 (cAMP PDE7A1) was induced by ER stresses in FRTL5 cells. While removing A23187 from the culture medium restored upregulation of cAMP PDE7A1 gene expression, removal of thapsigargin did not recover its expression. In addition, cAMP PDE7A1 gene expression was strongly inhibited by treatment with A23187 combined with thyroid stimulating hormone (TSH). The results are the first to show that ER stress induces cAMP PDE7A1 gene expression.
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문제 정의
본 연구자는 갑상선세포에서 DTT에 의해서 발현이 증가하는 유전자중의 하나로 cAMP PDE7A1을 보고하였다[8]. 본 연구에서는 ER stress에 의해서 cAMP PDE7A1의 발현증가와 다른 소포체샤페론의 발현에 어떤 상과성이 있는지를 규명함으로서 이 유전자발현 조절의 실마리를 제공하려고 한다.
특히, 이 조절 기전에서 ER stress에서 발현이 조절 되는 cAMP PDE7A1이 어떤 역할을 하는지를 밝히는 것이 연구의 최종목표이다. 본 연구에서는 ER stress의해서 세포내 2차 신호전달체중의 하나인 cAMP PDE7A1 유전자의 발현이 조절되는지를 확인하여, 장래에 ER stress에 의한 세포의 생사 조절에 cAMP PDE7A1이 어떻게 관련하는지를 밝히려고 한다. 이는 세포에 direct signal을 세포 내에서 어떻게 선택적으로 positive 혹은 negative하게 조절하는 기능으로 전환하는지를 이해할 수 있는 기회를 제공한다.
UPR이 세포의 보호와 사멸이라는 두 가지 상반된 기능을 담당하는 유전자들을 모두 발현시킨다는 것은, 이들 사이의 균형을 조절 및 유지하는 기전이 존재한다는 것을 의미한다. 특히, 이 조절 기전에서 ER stress에서 발현이 조절 되는 cAMP PDE7A1이 어떤 역할을 하는지를 밝히는 것이 연구의 최종목표이다. 본 연구에서는 ER stress의해서 세포내 2차 신호전달체중의 하나인 cAMP PDE7A1 유전자의 발현이 조절되는지를 확인하여, 장래에 ER stress에 의한 세포의 생사 조절에 cAMP PDE7A1이 어떻게 관련하는지를 밝히려고 한다.
제안 방법
1B는 칼슘이 cAMP PDE7A1 유전자발현에 미치는 영향을 알기 위하여 단순하게 ER lumen내의 칼슘교란을 유도하는 A23187과 intracellular Ca2+ pump (SERCA; sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase)에 직접 결합하여 칼슘교란을 유도하는 thapsigagin을 처리하여 비교 실험하였다. A23187과 thapsigagin을 각각 5시간 처리한 다음에 배지에서 각각을 제거한 후에 cAMP PDE7A1 유전자발현을 조사하였다. A23187를 제거한 다음에는 발현의 변화가 없이 계속 상승발현이 유지되지만 thapsigagin의 경우는 발현이 현저하게 저하되었다.
Coon's modified F-12 배양액에 5% calf serum, 1 mM non-essential amino acid, TSH (10 mU/ml), insulin (10 μ g/ml), hydrocortisone (0.4 ng/ml), transferrin (5 μg/ml)의 4가지 호르몬 혼합체를 첨가하여 만든 배양액(4 H 배양액)에 FRTL-5 세포주(Fisher rat thyroid)를 배양하였다.
약 500 μl의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 75% ethanol을 초기 RNA isolation reagent 양과 동일한 500 μl 넣고 12,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. DEPC가 처리된 증류수에 녹여 UV spectrophotometer로 정량하였다. 그 다음으로 수행한 RT-PCR은 RNA (3 μg)를 80℃에서 3분 가열하여 denaturation 시킨 후 바로 얼음에 담가둔다.
이는 세포 내 칼슘교란상태에서 TSH에 의해서 cAMP PDE7A1 유전자발현이 강하게 억제되는 새로운 결과를 얻었다. ER stress 유도를 하기 위하여 범용되는 XBP1 digestion 실험으로 간접적으로 ER stress sensor와 그 이후의 인자에 미치는 영향을 실험하였다[5]. Fig.
이 결과는 cAMP PDE7A1의 유전자발현이 UPR에 관여하는 인자들보다가 ER stress에 더욱 강하게 발현하는 것이다. Fig. 1B는 칼슘이 cAMP PDE7A1 유전자발현에 미치는 영향을 알기 위하여 단순하게 ER lumen내의 칼슘교란을 유도하는 A23187과 intracellular Ca2+ pump (SERCA; sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase)에 직접 결합하여 칼슘교란을 유도하는 thapsigagin을 처리하여 비교 실험하였다. A23187과 thapsigagin을 각각 5시간 처리한 다음에 배지에서 각각을 제거한 후에 cAMP PDE7A1 유전자발현을 조사하였다.
PCR 반응액 20 μl에 각각의 Forward 와 Reverse primer를 넣어서 94℃ 5분, 94℃ 30분, 57℃ 40초, 72℃ 40초로 27회 반복 하여 전기영동으로 확인하였다.
cAMP PDE7A1의 유전자발현이 각종 ER stress inducible drug (tunicamycin, A23187, DTT, BFA)에 반응하는지는 알기 위하여, tunicamycin을 처리하여 당단백질의 N-glycosylation 을 저해하여 ER lumen에 misfolded protein 축적을 유도, A23187을 처리하여 ER lumen내의 칼슘교란을 유도, DTT를 처리하여 ER lumen 내의 단백질 folding과정에서 -S-S- 형성 방해를 유도, BFA를 처리하여 분비단백질이 ER에서 Golgi complex로의 이동을 저해를 하였다. Fig.
반응이 끝난 후 94℃에서 2분 반응시켜 역전사효소를 inactivation시킨 다음 최종 100 μl로 맞춘다. 그다음 단계로 cDNA를 증폭하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR 반응액 20 μl에 각각의 Forward 와 Reverse primer를 넣어서 94℃ 5분, 94℃ 30분, 57℃ 40초, 72℃ 40초로 27회 반복 하여 전기영동으로 확인하였다.
성능/효과
cAMP PDE7A1의 유전자발현이 각종 ER stress inducible drug (tunicamycin, A23187, DTT, BFA)에 반응하는지는 알기 위하여, tunicamycin을 처리하여 당단백질의 N-glycosylation 을 저해하여 ER lumen에 misfolded protein 축적을 유도, A23187을 처리하여 ER lumen내의 칼슘교란을 유도, DTT를 처리하여 ER lumen 내의 단백질 folding과정에서 -S-S- 형성 방해를 유도, BFA를 처리하여 분비단백질이 ER에서 Golgi complex로의 이동을 저해를 하였다. Fig. 1A에서 각각의 ER stress 유도제에 의해서 ER chaperone (Bip, ERp29, Canx, hPDI), ER stress sensor (PERK, ATF6, Ire1)와 전사인자인 Chop의 발현이 모두 상승하였다, 특히 다른 것의 발현에 비하여 cAMP PDE7A1의 발현이 상승하였다. RpnI의 발현변화가 없는 것으로 보아 ER자체의 크기변화는 없는 것으로 추측되지만, 분비 당단백질인 Tg의 발현은 저하되는 것을 보여 세포가 적절한 ER stress 상태임을 알 수 있다.
1A에서 각각의 ER stress 유도제에 의해서 ER chaperone (Bip, ERp29, Canx, hPDI), ER stress sensor (PERK, ATF6, Ire1)와 전사인자인 Chop의 발현이 모두 상승하였다, 특히 다른 것의 발현에 비하여 cAMP PDE7A1의 발현이 상승하였다. RpnI의 발현변화가 없는 것으로 보아 ER자체의 크기변화는 없는 것으로 추측되지만, 분비 당단백질인 Tg의 발현은 저하되는 것을 보여 세포가 적절한 ER stress 상태임을 알 수 있다. 이 결과는 cAMP PDE7A1의 유전자발현이 UPR에 관여하는 인자들보다가 ER stress에 더욱 강하게 발현하는 것이다.
RpnI의 발현변화가 없는 것으로 보아 ER자체의 크기변화는 없는 것으로 추측되지만, 분비 당단백질인 Tg의 발현은 저하되는 것을 보여 세포가 적절한 ER stress 상태임을 알 수 있다. 이 결과는 cAMP PDE7A1의 유전자발현이 UPR에 관여하는 인자들보다가 ER stress에 더욱 강하게 발현하는 것이다. Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
소포체스트레스란?
세포는 외부의 급격한 환경변화에 대응하기 위하여 세포내 자체 조절능력을 가진다. 세포의 정상적인 생리 상태를 혼동시키는 것을 세포스트레스(cell stress)라고 하고, 그 중에서도 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 크게 영향을 미치는 것을 소포체스트레스(ER stress)라고 한다[9]. 일반적으로 ER stress는 분비경로를 통해서 분비되어야할 단백질에 구조이상이 생겨서 ER에 축적된다.
ER stress에 대응하는 세포의 기본적인 시스템은 무엇입니까?
그 원인은 변이단백질의 발현과 비정상적인 환경, 정상 분비단백질의 과잉생산일수도 있다. 이 같은 ER stress에 대응하는 가장 기본적인 것은 UPR (unfolded protein response; 소포체스트레스응답)라고 총칭 되는 특정 단백질의 전사유도와 총 단백질의 번역 억제 system이다[2]. 이때에 ER lumen에서 UPR에 관여하는 단백질들을 소포체샤페론(ER chaperone)이라고 하다.
소포체에서 분비 경로를 통해 분비되어야 할 단백질의 구조에 이상이 생기는 원인으로 추정되는 것은?
일반적으로 ER stress는 분비경로를 통해서 분비되어야할 단백질에 구조이상이 생겨서 ER에 축적된다. 그 원인은 변이단백질의 발현과 비정상적인 환경, 정상 분비단백질의 과잉생산일수도 있다. 이 같은 ER stress에 대응하는 가장 기본적인 것은 UPR (unfolded protein response; 소포체스트레스응답)라고 총칭 되는 특정 단백질의 전사유도와 총 단백질의 번역 억제 system이다[2].
참고문헌 (10)
Braakman, I. and N. J. Bulleid. 2011. Protein folding and modification in the mammalian endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 80, 71-99.
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Han, P., P. Sonati, C. Rubin, and T. Michaeli. 2006. PDE7A1, a cAMP-specific phosphodiesterase, inhibits cAMP-dependent protein kinase by a direct interaction with C. J. Biol. Chem. 281, 15050-15057.
Kwon, K., T. W. Goo, and O. Y. Kwon. 2005. Development of rapid detection method for unfolded protein response in the mammalian cells. J. Exp. Biomed. Sci. 11, 249-252.
Kwon, O. Y., Y. J. Kim, Y. Choi, H. Kim, C. Song, and M. Shong. 1999. The endoplasmic reticulum chaperone GRP94 is induced in the thyrocytes by cadmium. Z. Naturforsch C. 54, 573-577.
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