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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 ER stres와 관련된 기능적 변화와핵심적인 조절인자를 규명하기 위해, 인슐린 작용조직인 간세포에서 ER stress를 시간별로 유도한 후, expression micro- array로 유전자의 발현을 분석하였고, 이 expression profiles 을 GSECA의 방법으로 분석하였다.
제안 방법
- Hepl으로 ATCC 로부터 분양받았으며, 15% fetal bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 100 IU/ml penicillin, 100 gg/ml streptomycin등이 포함된 DMEM 성장배지를 사용하여 5% CC 37℃의 조건에서 배양하였다. ER stress 유도를 위해 SK-Hepl 에 thapsi- gargin을 1 gg/ml 농도로 4, 8, 12, 24, 48 시간 처리하였다.
- 분석하였다. 매우 유의적으로 expression coherence을 나타내는 gene sets을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene sets을 다시 발현이 비슷한것끼리 묶고 일반적인 k-means clustering algorithm을 이용하여 약 12종류의 clusters을 분류하였다(Fig. 2). 이들 중 발현이 ER stress 유도에 따라 증가하는 duster들과 감소하는 clus- ter들에 대해 유전자들의 기능들을 분석하였다fTable 1).
- Thsigargin을 시간별로 처리한 cell들과 처리하지 않은 cell들로부터 total RNA를 TRizol reagent (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, USA)으로 분리 하였으며, 이를 이용하여 double stranded cDNA 합성하였다. Biotin-labellinge Affymetrix Labelling Assay kit (Affymetrix Inc, USA) 을 이용하여 cDNA로부터 cRNA을 합성하면서 labelling하였으며, factionation된 biotin-labelled cRNA는 Human U133-Plus 2.
- Biotin-labellinge Affymetrix Labelling Assay kit (Affymetrix Inc, USA) 을 이용하여 cDNA로부터 cRNA을 합성하면서 labelling하였으며, factionation된 biotin-labelled cRNA는 Human U133-Plus 2.0 (Affymetrix Inc) chip과 18 시간 동안 hybridization을 행하였다. Hybridization image는 GeneChip operating Software (Affymetrix Inc)으로 scan하였으며, Affymetrix Inc에서 제공하는 Biconductor package로 expression level을 정량하였다.
- 0 (Affymetrix Inc) chip과 18 시간 동안 hybridization을 행하였다. Hybridization image는 GeneChip operating Software (Affymetrix Inc)으로 scan하였으며, Affymetrix Inc에서 제공하는 Biconductor package로 expression level을 정량하였다.
- Normalization값을 gene ontology (GO) 데이터베이스를이용하여 유전자를 기능적으로 분류하였고, 통계프로그램 인Hypergeometric distribution (GSEA) [이를 이용하여 유의한유전자군의 기능을 밝혔다. 유전자들을 기능별로 분류하기 위총H public gene database GO, KEGG, GenMAPP들을 바탕으로 유전자들을 grouping하였다.
- 모든 가능한 유전자쌍들에대해 Pearson correlation coefficient (PCC)을 계산하여 그 평균값을 각 functional gene s어에 대 총H expression coherence로사용하였다. 매우 높은 expression coherence# 가진 functional gene set을 위해 gene set에 속해있는 평균 expression값을 계산하여 비슷한 expression pattern을 나타내는 functional gene set을 hierachical clustering으로 나타내었다.
- Regulatory motif gene set을 이용하여 각각의 functional cluster의 putative transcriptional regulator을 GSEA 방법 [3]을 변형하여 분석하였다. 전반적인 방법은 GSEA방법과 유사하나, GSECA [2]에서는 gene ordering parameter로서 single to noise ratioo (SNR) 보다는 PCC를 사용하였다.
- SK-Hepl에 ER stress를 유도하기 위해 ER stress 유도물질인 thapsigarghi을 시간별4, 8, 12, 24, 48 시간)로 처리하였으며, ER stress marker protein 인 pE를 측정함으로써 ER stress 가 유도되 었음을 확인하였다(data not 아iown). Expression mi- croanaye thapsigargin을 처리한 각각의 세포로부터 total RNA을 분리 한 후 Affymetrix의 Human U133-Plus 2.
- 유도되 었음을 확인하였다(data not 아iown). Expression mi- croanaye thapsigargin을 처리한 각각의 세포로부터 total RNA을 분리 한 후 Affymetrix의 Human U133-Plus 2.0 chip을사용하여 유전자들의 발현을 분석하였다.
- 2). 이들 중 발현이 ER stress 유도에 따라 증가하는 duster들과 감소하는 clus- ter들에 대해 유전자들의 기능들을 분석하였다fTable 1). Table 1에서 보는 바와 같이 ER stress 유도에 따라 lysosome, sugar binding, ER lumen에 관련된 기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, DNA replication, DNA repair, cell cyde, electron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, small nucleolar ribonucleoprotein complex, DNA-dependent ATPase activiiy, RNA transcription 과 관련된 기능은 감소하였다.
- 결국 전사조절인자들의 상위 및 하위레벨에 해당하는 또 다른 전사인자와 이들과 상호작용하는 유전자들이 밝혀져야 할 것이다. 따라서, 본 연구에서는 ER stress 반응을 유도하는 조건하에서 당뇨관련조직인 간세포에서 유전자발현의 profiling을 확보하고, 이를 이용하여 ER stress에 의한 유전자들의 기능적 변화와 핵심전사조절전사인자를 in silico로 분석하였다.
- Tlnapisigargin을 시간별로 처리한 Sk-Hepl 세포에서 total RNA를 분리 하고 expression microarray을 행하여 유전자 발현 profiling을 확보하였다. 매우 유의적으로 expression co- herence을 나타내는 gene set을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene set을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶어 약 12 종류의 cluster로 분류하였다.
- profiling을 확보하였다. 매우 유의적으로 expression co- herence을 나타내는 gene set을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene set을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶어 약 12 종류의 cluster로 분류하였다. 이들의 유전자들 기능을 GSECA 의 방법[2]으로 분석하였을때, lysosome, sugar binding, ER lumen (Cluster 6) 에 관련된기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, nuclear mRNA splicing, DNA replication, DNA repair, cell cycle, dectron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, helicase activity, electron transport chain, responseto DNA damage 등의 기능은 감소하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 세포주는 간암세포인 SK.Hepl으로 ATCC 로부터 분양받았으며, 15% fetal bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 100 IU/ml penicillin, 100 gg/ml streptomycin등이 포함된 DMEM 성장배지를 사용하여 5% CC 37℃의 조건에서 배양하였다. ER stress 유도를 위해 SK-Hepl 에 thapsi- gargin을 1 gg/ml 농도로 4, 8, 12, 24, 48 시간 처리하였다.
데이터처리
- Normalization값을 gene ontology (GO) 데이터베이스를이용하여 유전자를 기능적으로 분류하였고, 통계프로그램 인Hypergeometric distribution (GSEA) [이를 이용하여 유의한유전자군의 기능을 밝혔다. 유전자들을 기능별로 분류하기 위총H public gene database GO, KEGG, GenMAPP들을 바탕으로 유전자들을 grouping하였다.
- 각 functione gene set에 대해 GSECA [8]을 이용하여 각유전자들의 상관성을 결정하였다. 모든 가능한 유전자쌍들에대해 Pearson correlation coefficient (PCC)을 계산하여 그 평균값을 각 functional gene s어에 대 총H expression coherence로사용하였다. 매우 높은 expression coherence# 가진 functional gene set을 위해 gene set에 속해있는 평균 expression값을 계산하여 비슷한 expression pattern을 나타내는 functional gene set을 hierachical clustering으로 나타내었다.
이론/모형
- 각 functione gene set에 대해 GSECA [8]을 이용하여 각유전자들의 상관성을 결정하였다. 모든 가능한 유전자쌍들에대해 Pearson correlation coefficient (PCC)을 계산하여 그 평균값을 각 functional gene s어에 대 총H expression coherence로사용하였다.
- putative transcriptional regulator을 GSEA 방법 [3]을 변형하여 분석하였다. 전반적인 방법은 GSEA방법과 유사하나, GSECA [2]에서는 gene ordering parameter로서 single to noise ratioo (SNR) 보다는 PCC를 사용하였다.
- ER stress에 의한 유전자들의 기능변화를 GSECA의 방법 [8] 으로 분석하였다. 매우 유의적으로 expression coherence을 나타내는 gene sets을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene sets을 다시 발현이 비슷한것끼리 묶고 일반적인 k-means clustering algorithm을 이용하여 약 12종류의 clusters을 분류하였다(Fig.
- 각각의 functional clusters에 속해있는 유전자들의 발현을조절하는 조절인자를 확인하기 위해, 각 유전자들의 promoter 에 존재하는 putative transcription factor motif을 이용하여 GSECA의 방법 [2]으로 분석하였다(Table 2). Ouster 3, 5, 7 과 duster 5, 8, 7, 9의 유전자들의 전사조절 인자를 분석한 결과, ER stress 유도에 따라 발현이 증가하는 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에 대해서는 FOXO4, AP-1, FOXO3, HNF4, IRF-1, GATA등의 전사인자들이 공통적으로 존재하였으며, ER stress유도에 따라 발현이 감소하는 유전자들의 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에서는 E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF등의 전사조절 인자들이 공통적으로 존재하였다.
성능/효과
- 방법 [2]으로 분석하였다(Table 2). Ouster 3, 5, 7 과 duster 5, 8, 7, 9의 유전자들의 전사조절 인자를 분석한 결과, ER stress 유도에 따라 발현이 증가하는 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에 대해서는 FOXO4, AP-1, FOXO3, HNF4, IRF-1, GATA등의 전사인자들이 공통적으로 존재하였으며, ER stress유도에 따라 발현이 감소하는 유전자들의 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에서는 E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF등의 전사조절 인자들이 공통적으로 존재하였다.
- 매우 유의적으로 expression co- herence을 나타내는 gene set을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene set을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶어 약 12 종류의 cluster로 분류하였다. 이들의 유전자들 기능을 GSECA 의 방법[2]으로 분석하였을때, lysosome, sugar binding, ER lumen (Cluster 6) 에 관련된기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, nuclear mRNA splicing, DNA replication, DNA repair, cell cycle, dectron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, helicase activity, electron transport chain, responseto DNA damage 등의 기능은 감소하였다. 이러한 기능의 변화는, ER stress가 유도되면 ER에 관련된 기능(ER lumen, ER to Golgi transporter) 이 증가하여, ER stress0)] 대응하여 세포를 방어하는 기능들이 증가하나, 새로운 단백질의 생성(DNAreplication, mRNA processing) 이나, ATP 생성 (Electron transport chain), DNA 수선(Response to DNA damage, DNA repair)과 세포분열(Mitosis) 등의 기능은 감소하는 것으로 나타났다.
- 이들의 유전자들 기능을 GSECA 의 방법[2]으로 분석하였을때, lysosome, sugar binding, ER lumen (Cluster 6) 에 관련된기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, nuclear mRNA splicing, DNA replication, DNA repair, cell cycle, dectron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, helicase activity, electron transport chain, responseto DNA damage 등의 기능은 감소하였다. 이러한 기능의 변화는, ER stress가 유도되면 ER에 관련된 기능(ER lumen, ER to Golgi transporter) 이 증가하여, ER stress0)] 대응하여 세포를 방어하는 기능들이 증가하나, 새로운 단백질의 생성(DNAreplication, mRNA processing) 이나, ATP 생성 (Electron transport chain), DNA 수선(Response to DNA damage, DNA repair)과 세포분열(Mitosis) 등의 기능은 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 ER stress가 유도되면, 1) ER에 주어지는과도한 부하를 감소시키는 기능들이 증가되어지나 2) ER stress가 점차 더 증가하면 mRNA transcription, ATP 생성이나 DNA repair 더 나아가 세포분열의 기능이 감소하여 세포의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
- 이러한 기능의 변화는, ER stress가 유도되면 ER에 관련된 기능(ER lumen, ER to Golgi transporter) 이 증가하여, ER stress0)] 대응하여 세포를 방어하는 기능들이 증가하나, 새로운 단백질의 생성(DNAreplication, mRNA processing) 이나, ATP 생성 (Electron transport chain), DNA 수선(Response to DNA damage, DNA repair)과 세포분열(Mitosis) 등의 기능은 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 ER stress가 유도되면, 1) ER에 주어지는과도한 부하를 감소시키는 기능들이 증가되어지나 2) ER stress가 점차 더 증가하면 mRNA transcription, ATP 생성이나 DNA repair 더 나아가 세포분열의 기능이 감소하여 세포의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
- ER stress에 의한 유전자의 조절에 관련된 전사조절인자들을 역시 생물정보학적 방법(GSECA)으로 분석하였을 때, FOXO4, AP-1, FOXO3, HNF4, IRF-1, GATA 등의 전사인자들이 ER stress에 의해 발현이 증가하는 유전자들의 promoter에공통적으로 존재하였으며, E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF 등의 전사인자들이 발현이 감소하는 유전자들의 promoter에서 공통적으로 존재하여, 이들의 전사인자들이 ER stress에 의한 유전자의 발현조절에 중요한 역할을하는 전사조절인자임을 알 수 있었다.
- 판단되었다. 또한 미토콘드리아 biogenesis에 매우 중요한 전사인자인 Nrf-1 이 ER stress에 의해 발현이 감소되는유전자들의 promoter에서 발견되어 졌는데, 이는 ER stress에의해 전자전달계의 기능이 감소하는 데에 관여할 것으로 생각되어졌다. 즉, ER stress에 의해 Nrf-1의 활성이 감소됨으로써전자전달계에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되어, 전자전달계의 기능이 감소할 뿐만 아니라 미토콘드리아의 기능도감소할 것으로 판단되었다.
- 또한 미토콘드리아 biogenesis에 매우 중요한 전사인자인 Nrf-1 이 ER stress에 의해 발현이 감소되는유전자들의 promoter에서 발견되어 졌는데, 이는 ER stress에의해 전자전달계의 기능이 감소하는 데에 관여할 것으로 생각되어졌다. 즉, ER stress에 의해 Nrf-1의 활성이 감소됨으로써전자전달계에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되어, 전자전달계의 기능이 감소할 뿐만 아니라 미토콘드리아의 기능도감소할 것으로 판단되었다.
후속연구
- ER stress에 의한 유전자발현의 조절은 전사적수준(transcriptional level)에서 이루어져, ATF6, ATF4, CHOP, XBP-1 등의 몇 몇 전사조절인자가 관여하는 것으로 알려져 있으나[12], 고둥동물의 전사조절이 다수의 전사조절인자 및 조절특이염기서열의 복잡한 조합으로 이루어진다는 점을 고려할 때 훨씬 많은 수의 전사조절인자가 상호작용하여 ER stress 반응을 조절할 것으로 여겨진다. 그러므로 ER stress 와 관련된 핵심적인 전사조절인자를 찾아 이들의 작용기전을밝히면, 질병발병에서의 역할규명 및 분자적 중재 방법 둥을개발할 수 있을 것이다.
- 특히, 고둥동물의 전사적조절이 다수의 전사조절인자와 결합염기서 열간의 다양한 결합패턴에의해서 결정된다는 점을 고려할 때, 훨씬 많은 수의 전사인자가 ER stress에 관여할 것으로 예측되어진다. 결국 전사조절인자들의 상위 및 하위레벨에 해당하는 또 다른 전사인자와 이들과 상호작용하는 유전자들이 밝혀져야 할 것이다. 따라서, 본 연구에서는 ER stress 반응을 유도하는 조건하에서 당뇨관련조직인 간세포에서 유전자발현의 profiling을 확보하고, 이를 이용하여 ER stress에 의한 유전자들의 기능적 변화와 핵심전사조절전사인자를 in silico로 분석하였다.
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