식물플랑크톤의 동정은 숙련된 전문가에게도 어려운 과제이다. 별 특징없는 외형과 다양한 크기와 종은 형태학적으로 구분하기에 어려움이 있다. 본 연구에서는 미생물 군집의 다양성을 분석하는데 효과적인 fingerprinting 기법인 PCR-DGGE 방법을 사용하여 이런 형태학적 동정의 제한점을 보완하고자 하는데 목적이 있다. 5곳의 호수 샘플로부터 2008년 8월 총 46개의 band를 찾을 수 있었고, 2008년 11월 총 26개 band를 찾을 수 있었다. 이 fingerprint 결과는 각각 다른 샘플링 장소를 비교하는데 용이하였다. 본 연구에서 PCR-DGGE 방법은 북한강 호수들의 플랑크톤 군집의 다양성을 파악하는데 사용되었고, 이 DGGE 기법이 플랑크톤의 동정기법으로써의 가능성을 검토해보았다.
식물플랑크톤의 동정은 숙련된 전문가에게도 어려운 과제이다. 별 특징없는 외형과 다양한 크기와 종은 형태학적으로 구분하기에 어려움이 있다. 본 연구에서는 미생물 군집의 다양성을 분석하는데 효과적인 fingerprinting 기법인 PCR-DGGE 방법을 사용하여 이런 형태학적 동정의 제한점을 보완하고자 하는데 목적이 있다. 5곳의 호수 샘플로부터 2008년 8월 총 46개의 band를 찾을 수 있었고, 2008년 11월 총 26개 band를 찾을 수 있었다. 이 fingerprint 결과는 각각 다른 샘플링 장소를 비교하는데 용이하였다. 본 연구에서 PCR-DGGE 방법은 북한강 호수들의 플랑크톤 군집의 다양성을 파악하는데 사용되었고, 이 DGGE 기법이 플랑크톤의 동정기법으로써의 가능성을 검토해보았다.
Taxonomic identification of phytoplankton has been a difficult task, even for the experienced taxonomist. Many non-descript, yet abundant, phytoplanktons do exist without distinguishing features which cause difficulties in morphological identification. Using PCR(polymerase chain reaction)-DGGE(denat...
Taxonomic identification of phytoplankton has been a difficult task, even for the experienced taxonomist. Many non-descript, yet abundant, phytoplanktons do exist without distinguishing features which cause difficulties in morphological identification. Using PCR(polymerase chain reaction)-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)method, which is known to be a powerfulfingerprinting technique to analyze diversity and dynamics of microbial populations, this study aimed to find the way to overcome the limitation of morphological identification. As a result, a total of 46 bands from samples in five lakes were detected in September and 27 bands in November. Fingerprinting results showed convenient and comparative analyses among each sampling site. In this study, PCR-DGGE method was used to figure out diversity and dynamics of plankton community in the lakes of North-Han River system. Also, the possibility of DGGE technique as an identification tool for phytoplankton was estimated.
Taxonomic identification of phytoplankton has been a difficult task, even for the experienced taxonomist. Many non-descript, yet abundant, phytoplanktons do exist without distinguishing features which cause difficulties in morphological identification. Using PCR(polymerase chain reaction)-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)method, which is known to be a powerfulfingerprinting technique to analyze diversity and dynamics of microbial populations, this study aimed to find the way to overcome the limitation of morphological identification. As a result, a total of 46 bands from samples in five lakes were detected in September and 27 bands in November. Fingerprinting results showed convenient and comparative analyses among each sampling site. In this study, PCR-DGGE method was used to figure out diversity and dynamics of plankton community in the lakes of North-Han River system. Also, the possibility of DGGE technique as an identification tool for phytoplankton was estimated.
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문제 정의
본 연구는 지금까지 대부분의 연구가 16S rRNA gene에 초점이 맞추어져 있고, 상대적으로 진핵생물 군집에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 상황에서, 우리나라 한강 수계의 5개 호수 플랑크톤의 비교 및 시기별 비교를 PCR-DGGE를 통해 시도해 보았다. PCR-DGGE는 지역 및 시기별 차이가 있는 샘플의 경우 비교가 용이하였으나, 다른 보완적인 방법과 병행하면 좀 더 정밀한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 수도권의 상수원으로써 중요한 역할을 담당하고 있는 북한강 수계의 파로호, 춘천호, 의암호, 소양호, 청평호를 대상으로 플랑크톤을 채집하여 진핵생물의 PCR-DGGE 분석을 실시하였다. 본 연구를 통해 다른 호수의 환경에서 플랑크톤 군집이 어떤 양상을 띠고 있는지 살펴보고, 플랑크톤 동정과 군집변화 측정수단으로써 PCR-DGGE 법의 응용가능성을 검토해 보았다.
본 연구에서는 수도권의 상수원으로써 중요한 역할을 담당하고 있는 북한강 수계의 파로호, 춘천호, 의암호, 소양호, 청평호를 대상으로 플랑크톤을 채집하여 진핵생물의 PCR-DGGE 분석을 실시하였다. 본 연구를 통해 다른 호수의 환경에서 플랑크톤 군집이 어떤 양상을 띠고 있는지 살펴보고, 플랑크톤 동정과 군집변화 측정수단으로써 PCR-DGGE 법의 응용가능성을 검토해 보았다.
제안 방법
DGGE profile에서 얻은 각 band에 대하여, 어떤 진핵생물에서 유래했는지 알기 위해 DNA를 추출 후 염기서열을 결정하였다. 2008년 9월 호수 샘플에서 3번은 Synedra속 혹은 Fragilaria속과 일치하는 결과를 보였으며 5번은 와편모조류로 나타났다.
Denaturing gradient gel 에서 각기 다른 위치에 존재하는 DNA를 회수하기 위해 band를 잘라낸 뒤 3차 증류수 100㎕를 첨가하여 voltexing후 15분정도 방치 하였다. 그 후 원심분리(8000rpm, 1분)하여 취한 상등액을 가지고 F1427 (5'-TCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3') 과 R1616 프라이머를 이용하여 위와 같은 조건의 PCR을 실시하였다.
이들 중 속과 종명이 동일한 결과와 해양에서 발견되는 것으로 보고되는 것은 목록에서 제외하였다. Denaturing gradient gel상 band의 위치와 강도는 E-box(Viber Lourmat, France)로 스캔한 사진을 분석하였다. 군집의 유사성을 분석하기 위해 사진상 각 조사지점의 밴드위치와 개수를 평행 비교하여 이진수 엑셀파일로 만든 후, XLstat2008(Addinsoft, U.
PCR 산물은 BioRad Dcode System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)으로 DGGE를 수행하였다. Denaturing gradient gel은 9% polyaclamide (37.5:1=acrylamide:bisacrylamide)에 urea와 formamide denaturing제를 30% ~ 65%까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 gradient former로 제작하였다. 이와 같이 제작된 gel을 1X TAE buffer (40mM tris, 20mM acetic acid, 1mM EDTA)가 든 60℃의 항온수조 안에 담그고 PCR 증폭산물 20μℓ을 loading dye 20μℓ과 함께 well에 loading하여 60℃, 120V로 15시간 30분 동안 전기영동하였다.
그 후 원심분리(8000rpm, 1분)하여 취한 상등액을 가지고 F1427 (5'-TCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3') 과 R1616 프라이머를 이용하여 위와 같은 조건의 PCR을 실시하였다. PCR product는 Zymoclean Gel DNA Recovery kit (ZYMO RESEARCH)을 이용하여 gel purification 하였고, Automatic DNA sequencing machine (ABI 3730, PE Applied Biosystems, U.S.A)으로 염기서열을 분석하였다. sequencing 결과에서 얻어진 염기서열을 이용하여 NCBI(http://www.
PCR 산물은 BioRad Dcode System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)으로 DGGE를 수행하였다. Denaturing gradient gel은 9% polyaclamide (37.
PCR 조성은 3μℓ의 주형 DNA와 2μℓ의 10X buffer(iNtRON), 1.6μℓ의 dNTPs(iNtRON), 1μℓ의 Mg2+(iNtRON), 1μℓ의 각각의 primer, 0.2μℓ의 i-star Taq polymerase(iNtRON)를 넣고 dH2O로 총 반응량을 20μℓ로 맞추었다.
이 때 이용된 PCR 기계는 PTC-100 (Peltier Thermal Cycler)이며, negative control도 함께 수행하였다. PCR 증폭산물의 존재와 분자량을 확인하기 위하여 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 DNA band를 확인하였다.
A)으로 염기서열을 분석하였다. sequencing 결과에서 얻어진 염기서열을 이용하여 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database에서 Blast search를 하여 sequence를 비교, 각각의 종을 확인하였다. Blast search 결과 출력되는 Max score 200이상의 결과 중에서 최고점의 결과 중 일치율이 97% 이상으로 검색되는 것만 결과로 출력하였다.
Denaturing gradient gel상 band의 위치와 강도는 E-box(Viber Lourmat, France)로 스캔한 사진을 분석하였다. 군집의 유사성을 분석하기 위해 사진상 각 조사지점의 밴드위치와 개수를 평행 비교하여 이진수 엑셀파일로 만든 후, XLstat2008(Addinsoft, U.S.A) 을 이용하여 Dice 유사도를 계산하고, unweighted pair group average를 사용하여 dendrogram으로 표현하였다.
그 후 원심분리(8000rpm, 1분)하여 취한 상등액을 가지고 F1427 (5'-TCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3') 과 R1616 프라이머를 이용하여 위와 같은 조건의 PCR을 실시하였다.
본 연구의 경우 PCR-DGGE profile의 band를 절단 후, sequencing하여 진핵생물인 플랑크톤종 동정을 시도하였고, 그 결과를 이용하여 호수별 유사성을 검토하고 시기별 비교를 해보았다. PCR-DGGE방법은 공간적으로 떨어진 군집을 한눈에 파악하게 해주었고 시기별 비교도 쉽게 가능하게 하였다.
북한강 수계 5개 호수에 대한 2008년 9월과 11월의 조사지점별 PCR-DGGE band의 개수를 비교해 보았다. 먼저 9월과 11월의 PCR-DGGE band의 숫자는 많은 차이를 보였다(Fig.
사진 상의 밴드의 수와 위치에 대한 정보를 이용 조사지점 별 서식지의 특성이 얼마나 다른가를 살펴보기 위하여 군집분석을 실시하였다. 예상대로 같은 호수의 지점들, 서로 옆에 위치한 호수들은 대체로 유사한 군집 양상을 보이고 있었다.
2007). 이 때 이용된 PCR 기계는 PTC-100 (Peltier Thermal Cycler)이며, negative control도 함께 수행하였다. PCR 증폭산물의 존재와 분자량을 확인하기 위하여 1.
대상 데이터
1). 2008년 9월과 2008년 11월 각 5개의 호수에서 세 지점씩 채수하였다. 시료는 수층 별로 채수된 물을 혼합하여 1ℓ를 취하였다.
본 연구는 LTER(16000-16001-2). 장기생태 및 KEITI (403-112-005) 생태계복원 관리기술, Green-river 연구사업단에 의해 지원되었습니다.
조사 지역은 파로호, 춘천호, 소양호, 의암호, 청평호의 북한강 수계의 5개 호수이다(Fig. 1). 2008년 9월과 2008년 11월 각 5개의 호수에서 세 지점씩 채수하였다.
플랑크톤 중 진핵생물의 종 다양성을 확인하기 위하여, 프라이머는 18S rDNA를 증폭할 수 있는 F1427GC와 R1616을 사용하였다(Table 1). PCR 조성은 3μℓ의 주형 DNA와 2μℓ의 10X buffer(iNtRON), 1.
2008년 11월 호수 샘플에서 식물플랑크톤으로 나타난 band는 1번, 3번, 4번, 7번, 9번, 10번 band였다(Appendix Table 2). 1번의 경우 Fragilaria 속과 Synedra 속이 같은 확률을 나타내었으며, 3번은 Eukaryotic picoplankton, 4번은 은편모조류인 Teleaulax amphioxeia로 동정되었다. 7번의 경우 같은 점수와 확률을 갖는 결과가 너무 많아 같은 속과 종이 포함되는 중복결과를 제외하고, 속은 같지만 종은 다른 결과를 모두 포함하였다.
2번은 원생동물 Deleptus sp. 4번은 섬모충, 6번은 담수 진핵생물, 7번은 갑각류인 Mastigodiaptomus, Eudiaptomus, Arctodiaptomus가 같은 정도의 상동성을 보였으며 8번은 지각류인 Bosmina longirostris로 나타났다(Appendix Table 1). 1번 band의 경우 200점 이상의 점수로 95%이상 규조류와 일치하는 검색결과가 다량 검색되었으나 similarity 97% 이상의 결과가 없어 동정목록에서는 제외되었다.
7번의 경우 같은 점수와 확률을 갖는 결과가 너무 많아 같은 속과 종이 포함되는 중복결과를 제외하고, 속은 같지만 종은 다른 결과를 모두 포함하였다. 7번은 형태학적 동정시 확인한 Cyclotella 속과 Stephanodiscus 속 둘중의 하나로 예상되나 염기서열만으로는 둥근모양의 규조류라는 것 외에는 알 수 없었다. 9번의 경우 Aulacoseira 속으로 동정되었으나 종은 알 수 없었다.
gov)의 GenBank database에서 Blast search를 하여 sequence를 비교, 각각의 종을 확인하였다. Blast search 결과 출력되는 Max score 200이상의 결과 중에서 최고점의 결과 중 일치율이 97% 이상으로 검색되는 것만 결과로 출력하였다. 이들 중 속과 종명이 동일한 결과와 해양에서 발견되는 것으로 보고되는 것은 목록에서 제외하였다.
2와 같다. 시료로부터 추출한 genomic DNA에서 18S rDNA의 증폭을 통해 획득한 250-300bp사이의 PCR산물을 DGGE에 적용한 결과 gel 상에서 다양한 위치의 band들을 확인 할 수 있었다. DGGE에서 분리된 밴드는 각각 다른 개체군을 의미한다는 점을 고려하면 매우 다양한 개체군이 존재하고 있음을 알 수 있다(Muyzer et al.
후속연구
본 연구는 지금까지 대부분의 연구가 16S rRNA gene에 초점이 맞추어져 있고, 상대적으로 진핵생물 군집에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 상황에서, 우리나라 한강 수계의 5개 호수 플랑크톤의 비교 및 시기별 비교를 PCR-DGGE를 통해 시도해 보았다. PCR-DGGE는 지역 및 시기별 차이가 있는 샘플의 경우 비교가 용이하였으나, 다른 보완적인 방법과 병행하면 좀 더 정밀한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
, 1999). 두 번째로, Primer의 길이를 200bp에서 500bp 정도로 길이를 늘림과 동시에 한국의 담수조류에 맞는 primer를 개발해야 할 필요성이 있다고 생각된다. 본 연구에서 찾아진 식물플랑크톤의 염기 서열의 경우 데이터베이스의 부족으로 similarity가 높은 염기서열을 찾기 어려웠다.
향후 종 동정을 위한 PCR-DGGE 실험에 있어서는 다음과 같은 사항의 보완이 요청된다. 먼저 정밀한 분석을 위해서는 Cloning을 거치거나, 형태학적 동정 등 다른 기법과의 결합이 필요할 것으로 보인다. Nubel et al.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식물플랑크톤의 동정이 어려운 까닭은 무엇인가?
식물플랑크톤의 동정은 숙련된 전문가에게도 어려운 과제이다. 별 특징없는 외형과 다양한 크기와 종은 형태학적으로 구분하기에 어려움이 있다. 본 연구에서는 미생물 군집의 다양성을 분석하는데 효과적인 fingerprinting 기법인 PCR-DGGE 방법을 사용하여 이런 형태학적 동정의 제한점을 보완하고자 하는데 목적이 있다.
플랑크톤이 수질과 수생태계의 건강지표로 사용되는 이유는 무엇인가?
플랑크톤은 대부분 물리적, 화학적 교란과 생태계 변화에 민감하게 반응하기 때문에 수질과 수생태계 건강의 좋은 지표인자이다(Ternjej and Tomec, 2005). 식물플랑크톤은 수중 생태계에서 일차 생산자이며, 식물플랑크톤 천이 상태를 통해 호수 환경 변화를 파악할 수 있으므로 중요하다.
수중 생태계에서 식물플랑크톤의 역할은 무엇인가?
플랑크톤은 대부분 물리적, 화학적 교란과 생태계 변화에 민감하게 반응하기 때문에 수질과 수생태계 건강의 좋은 지표인자이다(Ternjej and Tomec, 2005). 식물플랑크톤은 수중 생태계에서 일차 생산자이며, 식물플랑크톤 천이 상태를 통해 호수 환경 변화를 파악할 수 있으므로 중요하다. 그러나 식물플랑크톤의 동정은 별 특징 없는 외형과 다양한 크기와 종 때문에 숙련된 전문가에게도 매우 어려운 과제이다(Yan et al.
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