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문제 정의
- 본 연구에서는 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCRDGGE기술을 이용하여 탁주제조를 위한 전통누룩의 미생물 군집 다양성에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GCclamp인 NL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3')[3] 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA의 경우와 동일하게 수행하였다.
- DGGE running 조건은 두 경우 모두 8%의 polyacrylamide gel을 사용하였고 denaturant의 농도는 16S rRNA gene 일 때 40~60%, 28S rRNA gene 일 때 35~55%로 제작 하였으며 두 경우 모두 50V로 14 hr 동안 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 UV를 이용하여 확인하였다[2].
- DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested-PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다.
- DGGE는 Bio-Rad DcodeTM universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다.
- 균질화된 누룩 1 g을 생리식염수 9 ml에 첨가하여 연속희석 법으로 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA) 배지에 도말하여 접종하였다.
- 누룩으로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위한 세포파쇄를 위해 균질화된 누룩 1 g을 막자 사발에 넣고 액체질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다.
- 누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 16S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 세균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 2A에 나타내었다.
- 누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 28S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 누룩 진균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 3A에 나타내었다.
- 누룩으로부터 얻어진 총 genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR산물을 획득하였다.
- 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에 서 annealing 15초, 74℃에서 extension 50초 과정을 30 cycle 반복한 후, 74℃에서 5분 동안 post-extension하였다. 반응산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.
- 배양된 plate에서 대표 종과 PCR-DGGE profile에서 우점종과의 비교를 위해 상기 계수된 plate로부터 colony의 형태적인 차이에 의해 대표성을 갖는 세균 4종과 진균 8종을 순수분리하였다.
- 배양은 25℃에서 수행하였으며 PCA는 3일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다.
- 분리균을 대상으로 16S 및 28S rRNA gene염기서열을 결정하였으며 NCBI의 Gnenbank에 등록된 미생물과의 BLAST search를 통하여 가장 높은 유사성을 나타낸 종을 대상으로 동정한 결과는 Table 1에 나타내었다.
- 산성누룩의 Total DNA DGGE running에서 관찰 되는 16S rRNA gene, 28S rRNA gene band pattern에 의해 band로 판단한 부분을 E-tube에 담은 후 100 μl의 TE buffer를 넣고 elution 과정을 진행하였다.
- 세균과 진균의 PCR산물은 ㈜코스모진택사(한국)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.
- 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였으며[7], 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에서 annealing 15초, 74℃에서 extension 1분 과정을 30 cycle 반복한 후, 74℃에서 5분 동안 post-extension 하였다.
- 순수분리된 세균을 PCA에 도말하여 25℃에서 2일간 배양한 후 Insta Gene Matrix (Bio-Rad, USA)를 이용한 colony PCR을 수행하였다.
- 누룩시료로는 (유)금정산성토산주에서 산성막걸리 생산을 위해 제조된 산성누룩을 사용하였다. 시료의 균질화는 누룩 10g을 분쇄하여 이루어졌으며 이중 2 g은 미생물계수를 위해 그리고 2 g은 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)분석을 위해 이용하였으며 나머지는 균주 보관용 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
- 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 sequencing을 수행 하였다.
- 증폭을 위한 반응은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 16S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다.
- 진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic universal primer인 LROR primer (5'-ACC CGCTGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였으며 (Vilgalys, http://www.biology.ducke.edu/fungi/mycolab/primers.htm), 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에 서 annealing 15초, 74℃에서 extension 50초 과정을 30 cycle 반복한 후, 74℃에서 5분 동안 post-extension하였다.
- 진균의 경우 PDA에 도말하여 25℃에서 5일간 배양한 후 균체를 액체질소로 균질화 하였으며, PCR 증폭은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 28S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.
- 최종적으로 100 μl의 증류수에 용해한 후 1% agarose gel을 이용하여 전기영동을 한 후 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 확인하였다.
- 확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 에 등록되어있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT (developed by Dr. J. Chun, version 3.2) 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b[22]에 의한 alignment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.
대상 데이터
- 누룩시료로는 (유)금정산성토산주에서 산성막걸리 생산을 위해 제조된 산성누룩을 사용하였다.
- 용출된 밴드를 주형 DNA로 사용하여 16S rRNA gene 대상은 338F-GC, 518R primer, 28S rRNAgene 대상은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭하였다.
이론/모형
- 누룩으로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위한 세포파쇄를 위해 균질화된 누룩 1 g을 막자 사발에 넣고 액체질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 hot phenol extraction법 [11]에 의거하여 수행하였으며 그 방법은 다음과 같다. 액체질소에 첨가한 파쇄된 시료 0.
- 누룩에 존재하는 세균, 효모 및 사상성 진균의 세포(포자를 포함)로부터 total genomic DNA를 추출하기 위해 세포파쇄는 액체질소 균질화 방법을 적용하였다.
성능/효과
- halotolerans, Proteobacteria인 Pantoea agglomerans 그리고 유산균인 Pediococcus pentosaceus로 동정되었다.
- 8종의 분리된 진균은 조상균인 Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus, Rhizopus microspores (2종), 자낭균류인 Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, 그리고 효모성 진균인 Trichomonascus farinosus, Pichia kudriavzevii 로 동정되었다.
- 분자생물학적 기술은 미생물군집의 구조, 다양성을 밝히기 위해 이용되었으며, 미생물들은 16S 또는 28S rRNA gene과 같은 분자마커를 이용한 미생물의 동정을 위해 흔히 사용되어왔다[25]. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)분석에서 크기는 동일하나 서열이 다른 DNA 증폭자(amplicons)를 분리할 수 있었다. 이러한 기술은 토양[18], 해양[1], 곤충[17], sludge [23] 등 다양한 환경에서 미생물의 dynamics 연구를 위해 광범위하게 이용되고 있다.
- DGGE profile과 비교하여 PCA배지로부터 분리된 세균(Table 1)은 P. pentosaceus 와 Pantoea agglomerans 였으며 그 외는 일치하지 않았다.
- DGGE분석 결과 16개의 구분되는 band를 확인하였으며 그 중 3개의 band가 다른 band들에 비하여 밀도가 높게 나타나 주된 우점군으로 판단되었다.
- 국내에서 보고된 누룩 세균은 Bacillus, Micrococcus, Mycoplana, Erwinia, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter, Pseudomonas, Bacillus, Enterococcu으로 총 11개의 속[5,19,24,26]이며 기존에 보고된 2개의 속 외에 본 연구에서 새로 7속을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 DGGE profile에서 총 8개의 구분되는 band를 확인하였으며 2개의 band가(E7과 E8) 상대적으로 밀도가 높아 우점군으로 판단된다.
- 그 결과 Lactobacillus속(2종), Pediococcous속, Weissella속(2종), Staphylococcus속, Pantoea속(2종)으로 나타났으며 그 외 uncultured bacterium, endophytic bacterium, unculturedCyanobacteria와 Actinobacteria로 총 9속을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 누룩 진균은 Pichia 속, Torulaspora 속, Wickerhamomyces 속, Sacharomycopsis 속, Aspergillus 속으로 5개의 속이었다.
- 누룩에서 순수분리된 균주와 비교하였을 때 DGGE 분석결과는 누룩 세균군집의 다양성을 보다 효율적으로 확인할 수 있었을 뿐만 아니라 종간의 풍부성(richness)의 상대적인 비교를 간접적으로 확인할 수 있었다(Table 1; Fig. 2).
- 누룩으로부터 분리된 진균은 종 8종으로 효모성 진균이 2종 그리고 조상균이 4종 그리고 자낭균이 2종으로(Table 1) DGGE 분석결과와 비교하였을 때 P. kudriavzevii 와 A. oryzae인 2종만이 일치하였다.
- 또한 DGGE 분석에서 높은 밀도를 보인 E7은 Pichia kudriavzevii 그리고 E8은 A. oryzae로 동정되어 (유)금정산성토산주의 누룩에서 주된 진균으 로 나타났다.
- 세균의 경우 배양 가능한 8종과 비배양균인 4종의 존재를 확인하였다. 또한 진균의 경우 다양한 효모와 사상성 진균의 존재를 확인하였다. 반면 PCR-DGGE방법의 종의 검출한계성으로 낮은 개체수의 종까지 설명하는 데는 한계성이 있음을 확인하였다.
- 반면 PCR-DGGE방법의 종의 검출한계성으로 낮은 개체수의 종까지 설명하는 데는 한계성이 있음을 확인하였다.
- 본 연구로부터 PCR-DGGE를 이용한 분자학적 기법은 누룩에서 세균, 효모 및 진균의 다양성을 설명하는 데 유의한 분석 방법임을 확인하였다.
- 본 연구로부터 PCR-DGGE를 이용한 분자학적 기법은 누룩에서 세균, 효모 및 진균의 다양성을 설명하는 데 유의한 분석 방법임을 확인하였다. 세균의 경우 배양 가능한 8종과 비배양균인 4종의 존재를 확인하였다. 또한 진균의 경우 다양한 효모와 사상성 진균의 존재를 확인하였다.
후속연구
- 그러나 PCR-DGGE기술은 누룩 내 존재하는 종의 다양성을 효율적으로 설명하고 있어 누룩 내 존재하는 유용한 미생물자원의 확보 그리고 누룩의 기능, 품질평가 및 개량누룩의 개발 등을 연구하는 데 유용한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
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