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문제 정의
- 최근 오리육의 소비량 증가에 따라 오리 우모 발생량도 크게 증가하고 있으나 오리 우모 분해에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않고 있으며, 케라틴 분해미생물의 분해 가능한 케라틴 기질의 종류에 대한 연구 역시 극소수에 불과하다. 따라서 본 연구에서는 다양한 시료로부터 오리 우모를 분해할 수 있는 미생물을 광범위하게 분리 및 동정한 후, 그 기질 특이성 등을 조사함으로써 다양한 분야에 응용 가능성이 있는 새로운 토착 미생물 자원을 확보하고자 하였다.
- 닭 우모케라틴을 분해할 수 있는 미생물에 대한 연구는 매우 많은 편이지만 최근 그 발생량이 증가하고 있는 오리 우모케라틴을 분해할 수 있는 미생물에 대한 연구는 전무할 실정이다. 따라서 본 연구에서는 오리 우모케라틴을 분해할 수 있는 세균을 각종 시료로부터 광범위하게 분리 및 동정하고, 그 기질 특이성을 조사함으로써 다양한 케라틴 폐기물의 응용 가능성을 도출하고자 하였다. 양계장 주변 토양과 분변, 폐우모 및 모발 조각으로부터 오리 우모를 효율적으로 분해할 수 있는 12 균주를 분리하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열에 근거하여 각각 Bacillus methylotrophicus, Pseudomonas geniculata, Pseudomonas hibiscicola, Exiquobacterium profundum, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Chryseobacterium indologenes, Bacillus thuringiensis, Thermomonas koreensis로 동정되었다.
제안 방법
- coli 16S rRNA gene의 conserved sequence를 기초로 하여 합성된 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') primer와 1492R(5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다(Lane, 1991). 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, NCBI GenBank의 database를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, MEGA 4 프로그램을 이용하여 실험균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다.
- 각 시료 1g을 멸균수에 현탁 및 진탕한 후, 단계적으로 희석하여 skim milk 평판배지에 접종하였다. 30℃에서 배양하면서 proteolysis 결과로서 투명대를 형성하는 집락을 선정하여 순수분리하였다. 순수분리된 각 균주는 기질로 오리 우모 0.
- 경남 일원의 오리 농장과 닭 농장 주변의 토양, 분변 및 폐우모, 가정 샤워실의 배수구에 축적되어 있는 사람의 모발 조각 등을 시료로 채취하였다. 각 시료 1g을 멸균수에 현탁 및 진탕한 후, 단계적으로 희석하여 skim milk 평판배지에 접종하였다. 30℃에서 배양하면서 proteolysis 결과로서 투명대를 형성하는 집락을 선정하여 순수분리하였다.
- 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, NCBI GenBank의 database를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, MEGA 4 프로그램을 이용하여 실험균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다.
- 배양시간 경과에 따른 우모 분해효소인 keratinase 의 활성을 조사하기 위하여 우모 분해에 최적이었던 각 배지에 실험균주를 접종하여 배양하였으며, 그 결과는 Fig. 3에서 보는 바와 같다. C20, D14, D27 균주는 배양 1일 경, C9, C10, C16 균주는 배양 2일 경, D13, H8, H13 균주는 배양 3일 경, D38, H7, H10 균주는 배양 4일 경 가장 높은 keratinase 활성을 나타내었다.
- 사람의 손발톱은 homogenizer로 마쇄하여 사용하였다. 배지에 각 기질을 0.1%씩 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 7일 동안 배양한 후, 분해율을 측정하였다.
- 본 실험결과를 고려할 때, 우모 분해미생물의 생리적 특성은 다양한 것으로 판단된다. 분리균주 중, 우모 분해율이 대체로 우수하였던 가정 배수구에 축적된 모발 조각으로부터 분리된 H7, H8, H10, H13 균주, 양계장 주변 토양 및 양계 분변으로부터 분리된 C9, C10, C16, C20, 폐우모로부터 분리된 D13, D14, D38균주를 최종 실험균주로 선정하였다.
- 30℃에서 배양하면서 proteolysis 결과로서 투명대를 형성하는 집락을 선정하여 순수분리하였다. 순수분리된 각 균주는 기질로 오리 우모 0.1%가 첨가된 N 배지 및 NN 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 7일 동안 배양한 후, 우모의 분해율을 측정하였다. 최종 실험균주는 분리 균주들의 집락 특성 차이 및 우모 분해율을 고려하여 선정하였다.
- 실험균주들의 집락 특성을 Manual of methods for general bacteriology(Gerhardt 등, 1981)에 의거하여 조사한 후, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하여 실험균주를 동정하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 E.
- 실험균주에 의하여 분해 가능한 케라틴 기질의 종류를 조사하기 위하여 오리 우모 외 닭 우모, 양모, 사람의 모발 및 손발톱 0.1%를 배지에 첨가하여 7일 동안 배양한 후, 기질의 분해율을 조사한 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같다. 실험균주들은 사람의 모발을 제외한 모든 케라틴 기질을 분해할 수 있었다.
- 1). 이들을 우모가 첨가된 NN 배지에 접종하여 배양하면서 우모 분해를 육안으로 확인한 후, 78 균주를 재분리하였다. 최종 실험균주 선정을 위하여 이들 균주를 N 배지 및 NN 배지에 접종하여 7일 동안 배양한 후, 우모의 분해율을 확인하였으며, 그 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다.
- 이들을 우모가 첨가된 NN 배지에 접종하여 배양하면서 우모 분해를 육안으로 확인한 후, 78 균주를 재분리하였다. 최종 실험균주 선정을 위하여 이들 균주를 N 배지 및 NN 배지에 접종하여 7일 동안 배양한 후, 우모의 분해율을 확인하였으며, 그 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 분리균주에 따라 우모 분해율은 0-91.
- 1%가 첨가된 N 배지 및 NN 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 7일 동안 배양한 후, 우모의 분해율을 측정하였다. 최종 실험균주는 분리 균주들의 집락 특성 차이 및 우모 분해율을 고려하여 선정하였다. 이때 사용한 skim milk 평판배지의 조성은 tryptone 1%, yeast extract 0.
대상 데이터
- 경남 일원의 오리 농장과 닭 농장 주변의 토양, 분변 및 폐우모, 가정 샤워실의 배수구에 축적되어 있는 사람의 모발 조각 등을 시료로 채취하였다. 각 시료 1g을 멸균수에 현탁 및 진탕한 후, 단계적으로 희석하여 skim milk 평판배지에 접종하였다.
- 분해 가능한 케라틴 기질의 종류를 조사하기 위하여 닭 우모, 사람의 모발 및 손발톱, 양모를 사용하였다. 사람의 손발톱은 homogenizer로 마쇄하여 사용하였다.
- 수집한 각 시료로부터 skim milk 평판배지 상에서 직경 1 cm 이상의 투명환을 생성하는 234 균주를 분리하였다(Fig. 1). 이들을 우모가 첨가된 NN 배지에 접종하여 배양하면서 우모 분해를 육안으로 확인한 후, 78 균주를 재분리하였다.
이론/모형
- 배양액을 13000 rpm, 4℃에서 30분 간 원심분리한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다. Keratinase 활성은 Wawrzkiewicz 등(1987)의 방법에 따라 조제된 keratin powder를 기질로 사용하여 측정하였다. 조효소액 2 ml를 0.
- 실험균주에 의한 케라틴 분해율은 케라틴의 건조무게 감소량을 측정함으로써 정량한 후, % 백분율로 나타내었다. Soluble protein은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Bradford method(1976)에 의하여 측정하였으며, 균체 생육도는 배양액 중 미분해 케라틴을 Whatman no. 1 여과지를 이용하여 제거한 후, 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 조사하였다.
성능/효과
- 3에서 보는 바와 같다. C20, D14, D27 균주는 배양 1일 경, C9, C10, C16 균주는 배양 2일 경, D13, H8, H13 균주는 배양 3일 경, D38, H7, H10 균주는 배양 4일 경 가장 높은 keratinase 활성을 나타내었다. 최대 keratinase 활성을 나타낸 후, 전반적으로 효소활성은 약간 감소하는 경향을 보여주었다.
- Soluble protein의 농도는 우모가 분해되었음을 나타내는 간접적인 지표로 이용된다(Onifade 등, 1998). 그러나 앞 실험에서 살펴보았듯이 keratinase 생산량과 우모 분해는 정확하게 일치하지 않았고, 결과적으로 우모 분해의 증거인 soluble protein 농도 역시 비슷한 경향을 나타낸 것으로 판단된다. 한편 배양 후, 배지의 pH는 7.
- 실험균주를 보다 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI GenBank 에 등록된 각 표준균주와 비교한 결과, C9 균주는 Bacillus methylotrophicus와 98%, C10 및 H10 균주는 Pseudomonas geniculata와 98% 및 97%, C16 균주는 Pseudomonas hibiscicola와 97%, C20 균주는 Exiquobacterium profundum와 99%, D13 균주는 Bacillus pumilus와 98%, D14 균주는 Bacillus amyloliquefaciens와 97%, D27 균주는 Chryseobacterium indologenes와 99%, D38, H7 및 H8 균주는 Bacillus thuringiensis와 97%, 99% 및 98%, H13 균주는 Thermomonas koreensis와 99%의 상동성을 나타내었다. 또한 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 균주들과의 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수를 작성한 결과, 각 실험균주들은 상기에서 언급한 각 표준균주를 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있었다(Fig. 2). 현재 우모를 분해할 수 있는 세균으로 Bacillus 속, 특히 B.
- 실험균주들은 간균 또는 단간균의 형태를 가졌으며, C10, C16, D27, H10 및 H13 균주는 그람음성세균, 나머지 균주들은 그람양성세균이었다. 또한 nutrient 평판배지 상에서 균주에 따라 서로 상이한 모양, 주변부, 투명도, 색깔 등 다양한 집락 특성을 나타내었다.
- 우모 분해율에 차이가 거의 없는 그룹은 우모 분해효소인 keratinase 생성에 nitrogen repression이 작용하지 않았음을 시사한다(Gupta 등, 2002). 또한 두 배지에서 우모 분해율의 차이가 있는 그룹은 N 배지에서의 분해율이 더 높은 경우와 NN 배지에서 더 높은 경우로 구분될 수 있었다. 이 경우, NN 배지에서의 분해율이 높은 것은 keratinase 생성에 nitrogen repression이 작용했음을, N 배지에서의 분해율이 높은 것은 nitrogen activation이 작용했음을 나타낸다(Gupta 등, 2002; Rao 등, 1998).
- 실험균주 중, H14 균주는 질소원의 첨가가 keratinase의 생성을 완전히 저해함을 알 수 있었다. 본 실험결과를 고려할 때, 우모 분해미생물의 생리적 특성은 다양한 것으로 판단된다. 분리균주 중, 우모 분해율이 대체로 우수하였던 가정 배수구에 축적된 모발 조각으로부터 분리된 H7, H8, H10, H13 균주, 양계장 주변 토양 및 양계 분변으로부터 분리된 C9, C10, C16, C20, 폐우모로부터 분리된 D13, D14, D38균주를 최종 실험균주로 선정하였다.
- 이러한 결과는 균주에 따라 keratinase 생산 시기가 서로 다르며, 결과적으로 우모 이용 목적에 맞게 적합한 균주를 선택할 수 있음을 의미한다. 본 연구 결과에 의하면, 우모의 분해율과 keratinase 생산량은 반드시 비례하지는 않았는데, 오리 우모는 불용성 기질이며, 또한 각 실험에 사용된 우모의 형태에 따라 keratinase와 기질 간의 접촉이 일정하게 일어나지 않음으로써 이런 현상이 발생하는 것으로 추정되었다(Son 등, 2004). 그리고 keratinase의 생산량이 많음에도 불구하고 우모 분해율이 높지 않은 이유는 keratinase와 함께 우모케라틴을 효율적으로 분해하는데 필요한 accessory protein이 제거되었거나 그 생산이 억제된 것에 기인한다는 보고가 있다(Singh, 2002).
- 최종 실험균주 선정을 위하여 이들 균주를 N 배지 및 NN 배지에 접종하여 7일 동안 배양한 후, 우모의 분해율을 확인하였으며, 그 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 분리균주에 따라 우모 분해율은 0-91.5%로 다양하게 나타났으며, 질소원이 첨가된 N 배지와 질소원이 첨가되지 않은 NN 배지에서의 우모 분해율이 비슷한 그룹과 그렇지 않은 그룹으로 구분될 수 있었다. 우모 분해율에 차이가 거의 없는 그룹은 우모 분해효소인 keratinase 생성에 nitrogen repression이 작용하지 않았음을 시사한다(Gupta 등, 2002).
- 최대 keratinase 활성을 나타낸 후, 전반적으로 효소활성은 약간 감소하는 경향을 보여주었다. 실험 균주 중, Chryseobacterium indologenes D27 균주의 keratinase 활성이 가장 높았으며, Exiquobacterium profundum C20 균주의 활성이 가장 낮았다. 이러한 결과는 균주에 따라 keratinase 생산 시기가 서로 다르며, 결과적으로 우모 이용 목적에 맞게 적합한 균주를 선택할 수 있음을 의미한다.
- 이 경우, NN 배지에서의 분해율이 높은 것은 keratinase 생성에 nitrogen repression이 작용했음을, N 배지에서의 분해율이 높은 것은 nitrogen activation이 작용했음을 나타낸다(Gupta 등, 2002; Rao 등, 1998). 실험균주 중, H14 균주는 질소원의 첨가가 keratinase의 생성을 완전히 저해함을 알 수 있었다. 본 실험결과를 고려할 때, 우모 분해미생물의 생리적 특성은 다양한 것으로 판단된다.
- 실험균주의 형태학적, 배양적 특성은 Table 2에서 보는 바와 같다. 실험균주들은 간균 또는 단간균의 형태를 가졌으며, C10, C16, D27, H10 및 H13 균주는 그람음성세균, 나머지 균주들은 그람양성세균이었다. 또한 nutrient 평판배지 상에서 균주에 따라 서로 상이한 모양, 주변부, 투명도, 색깔 등 다양한 집락 특성을 나타내었다.
- 우모 분해와 keratinase 활성은 정확하게 비례하지 않았다. 실험균주들의 기질 특이성을 조사한 결과, 닭 우모는 53.8-91.4%, 양모는 40.3-93.0%, 손발톱은 51.0-82.9%의 분해율을 나타내었으나, 사람의 모발은 분해할 수 없었다. 본 실험에서 분리된 케라틴 분해균주들은 우모의 영양적 가치 개선뿐만 아니라 양모의 질 개선, 동물 발굽의 처리 등 다양한 용도로 활용 가능할 것으로 판단된다.
- 실험균주를 보다 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI GenBank 에 등록된 각 표준균주와 비교한 결과, C9 균주는 Bacillus methylotrophicus와 98%, C10 및 H10 균주는 Pseudomonas geniculata와 98% 및 97%, C16 균주는 Pseudomonas hibiscicola와 97%, C20 균주는 Exiquobacterium profundum와 99%, D13 균주는 Bacillus pumilus와 98%, D14 균주는 Bacillus amyloliquefaciens와 97%, D27 균주는 Chryseobacterium indologenes와 99%, D38, H7 및 H8 균주는 Bacillus thuringiensis와 97%, 99% 및 98%, H13 균주는 Thermomonas koreensis와 99%의 상동성을 나타내었다. 또한 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 균주들과의 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수를 작성한 결과, 각 실험균주들은 상기에서 언급한 각 표준균주를 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있었다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 오리 우모케라틴을 분해할 수 있는 세균을 각종 시료로부터 광범위하게 분리 및 동정하고, 그 기질 특이성을 조사함으로써 다양한 케라틴 폐기물의 응용 가능성을 도출하고자 하였다. 양계장 주변 토양과 분변, 폐우모 및 모발 조각으로부터 오리 우모를 효율적으로 분해할 수 있는 12 균주를 분리하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열에 근거하여 각각 Bacillus methylotrophicus, Pseudomonas geniculata, Pseudomonas hibiscicola, Exiquobacterium profundum, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Chryseobacterium indologenes, Bacillus thuringiensis, Thermomonas koreensis로 동정되었다. 전반적으로 이들 실험균주의 keratinase 활성은 다양하게 나타났으며, Chryseobacterium indologenes D27 균주가 가장 높은 효소활성을 나타내었다.
- 등이 보고되어 있다(Brandelli, 2008). 우모를 분해할 수 있는 B. methylotrophicus, B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis, Pseudomonas geniculata, P. hibiscicola, Exiquobacterium profundum, Thermomonas koreensis의 분리에 대한보고는 본 논문이 최초로서, 이것은 환경 중 우모 분해 세균이 매우 다양함을 시사한다.
- 실험 균주 중, Chryseobacterium indologenes D27 균주의 keratinase 활성이 가장 높았으며, Exiquobacterium profundum C20 균주의 활성이 가장 낮았다. 이러한 결과는 균주에 따라 keratinase 생산 시기가 서로 다르며, 결과적으로 우모 이용 목적에 맞게 적합한 균주를 선택할 수 있음을 의미한다. 본 연구 결과에 의하면, 우모의 분해율과 keratinase 생산량은 반드시 비례하지는 않았는데, 오리 우모는 불용성 기질이며, 또한 각 실험에 사용된 우모의 형태에 따라 keratinase와 기질 간의 접촉이 일정하게 일어나지 않음으로써 이런 현상이 발생하는 것으로 추정되었다(Son 등, 2004).
- 양계장 주변 토양과 분변, 폐우모 및 모발 조각으로부터 오리 우모를 효율적으로 분해할 수 있는 12 균주를 분리하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열에 근거하여 각각 Bacillus methylotrophicus, Pseudomonas geniculata, Pseudomonas hibiscicola, Exiquobacterium profundum, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Chryseobacterium indologenes, Bacillus thuringiensis, Thermomonas koreensis로 동정되었다. 전반적으로 이들 실험균주의 keratinase 활성은 다양하게 나타났으며, Chryseobacterium indologenes D27 균주가 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 우모 분해와 keratinase 활성은 정확하게 비례하지 않았다.
- C20, D14, D27 균주는 배양 1일 경, C9, C10, C16 균주는 배양 2일 경, D13, H8, H13 균주는 배양 3일 경, D38, H7, H10 균주는 배양 4일 경 가장 높은 keratinase 활성을 나타내었다. 최대 keratinase 활성을 나타낸 후, 전반적으로 효소활성은 약간 감소하는 경향을 보여주었다. 실험 균주 중, Chryseobacterium indologenes D27 균주의 keratinase 활성이 가장 높았으며, Exiquobacterium profundum C20 균주의 활성이 가장 낮았다.
후속연구
- 최근 미생물유래 keratinase는 질소비료, 화장품 및 생분해성 필름의 개발 등에 응용 가능성이 타진되고 있으며, 광우병 유발 인자인 prion을 분해할 수 있는 잠재적 가능성이 큰 것으로 알려져 있다(Langeveld 등, 2003; Onifade 등, 1998). 따라서 keratinase 활성이 높은 미생물의 분리 및 그 특성 규명은 케라틴 폐기물의 생물학적 처리뿐만 아니라 다양한 용도로 응용을 위해서도 반드시 필요한 연구라고 판단된다. 미국의 경우를 보면, 이미 20년 전부터 우모 케라틴을 미생물학적으로 분해한 후, 그 분해산물을 아미노산 공급원으로 자원화할 수 있는 생물학적 처리법의 개발에 연구를 집중하고 있다(Lin 등, 1992).
- 따라서 최근 keratinase를 처리하여 염색도 향상, 오구 제거 및 부드러운 촉감의 양모를 획득하고자 하는 연구가 진행되고 있다(Infante 등, 2010). 따라서 실험균주들이 생산하는 keratinase는 가금 우모 처리뿐만 아니라 양모의 품질 개선, 손발톱과 같은 성질의 동물의 뿔, 발굽 등의 처리에도 이용 가능성이 높을 것으로 판단된다. Fig.
- 그리고 keratinase의 생산량이 많음에도 불구하고 우모 분해율이 높지 않은 이유는 keratinase와 함께 우모케라틴을 효율적으로 분해하는데 필요한 accessory protein이 제거되었거나 그 생산이 억제된 것에 기인한다는 보고가 있다(Singh, 2002). 따라서 향후 이에 대한 보다 추가적인 연구가 필요함을 알 수 있었다.
- 9%의 분해율을 나타내었으나, 사람의 모발은 분해할 수 없었다. 본 실험에서 분리된 케라틴 분해균주들은 우모의 영양적 가치 개선뿐만 아니라 양모의 질 개선, 동물 발굽의 처리 등 다양한 용도로 활용 가능할 것으로 판단된다.
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