[논문]팔레놉시스 조직배양 및 형질전환 최근 연구동향

노희선; 이상일; 이이레; 백선영; 김종보

doi:10.5010/jpb.2012.39.4.225

팔레놉시스 조직배양 및 형질전환 최근 연구동향
Recent trends in tissue culture and genetic transformation of Phalaenopsis 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.39 no.4, 2012년, pp.225 - 234

노희선 (건국대학교 의료생명대학 생명공학과) , 이상일 (건국대학교 의료생명대학 생명공학과) , 이이레 (건국대학교 의료생명대학 생명공학과) , 백선영 (건국대학교 의료생명대학 생명공학과) , 김종보 (건국대학교 의료생명대학 생명공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

This report describes recent advances in tissue culture and genetic transformation of commercial Phalaenopsis. Recently, an importance of Phalaenopsis has been increased due to its popularity with beautiful flowers and is widely used for pot plants as well as cut-flower. Its use is rapidly enlarging in worldwide. Thus, demands for the release of new elite cultivars in Phalaenopsis have been increased. During the last several decades, some critical progresses have been made in tissue culture and genetic transformation in Phalaenopsis species. Cooperation with these biotechnological methods are supposed to promote the release of commercial Phalaenopsis cultivars in the near future. Until now, no technical review on tissue culture and genetic transformation in Phalaenopsis has been reported in Korea. Therefore, we inquired the brief history and techniques of tissue culture system in Korea.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

(2006)은 PLB의 팔레놉시스 조직으로부터 직접 다신초 형성에 관하여 보고 하였다. PLB 혹은 callus 유도를 통해 생산한 조직배양 묘는 변이 발생율이 높아, 상업적 이용가치가 저하 되므로 이에 대한 대안을 마련하고자 PLB, callus 과정을 거치지 않고 직접 다신초를 유도하여 식물체를 생산고자 수행하였다.
본 논문에서는 이러한 중요성을 지닌 양란 중 팔레놉시스 우량 품종 증식 및 보급에 널리 사용되는 조직배양 기술 그리고 향후 전통육종기술과 결합하여 새롭게 창출된 유전 변이를 이용하여 소비자 수요를 충족시키고 생산비를 절감할 수 있는 형질전환 기술을 이용하는 사례 등에 관한 최근 연구동향을 보고하고자 한다.

제안 방법

Particle bombardment를 이용한 형질전환에서 bombardment 전 PLB는 실험 2일 전에 VWAB 배지의 중앙에 직경 3 ~ 4 cm의 원모양으로 치상하여 둔다. 그 후 gold 코팅 된 유전자를 Biolistic Particle Delivery System(PDS-1000/He, Bio-rad, USA)을 이용하여 목표 식물체와 microcarrier간의 거리 6 cm, 사출 압력 1,350 psi, vaccum 압력 25 in Hg 하에서 1회 bombardment 후 4주간 PPT-free 배지에서 휴식기간을 주었다. 이후 PPT 5 mg/l가 첨가되어 있는 VWAB 선발 배지에서 12주간 선발 후, 생존 한 PLB만 항생제가 첨가되지 않은 VWAB 배지로 계대하여 재분화를 유도하였다.
7%의 선발 효율을 보였다. 선발한 팔레놉시스는 PCR, Southern blot, Northern blot 그리고 Western blot을 수행하여 CymMV-ORSV의 CP gene의 삽입과 발현 여부를 검정하였다. 마찬 가지로 Fan(2011b)에서는 ORSV에 내성을 갖는 품종을 육종하고자 수행한 실험에서 위와 같은 조건으로 선발 시 고체에서 18.
접종한 PLB는 acetosyringone 100 μM이 첨가된 VWAB배지에서 3일간 암조건에서 공동배양 후, 수세배지(Table 1)를 이용하여 수세하였다. 수세 후 PLB는 200 mg/l의 cefotaxime이 첨가된 PPT-free 배지에서 4주간 휴식 후, 5 mg/l PPT와 200 mg/l의 cefotaxime이 첨가된 선발 배지에서 12 주간 선발 되었다. 선발된 식물체는 cefotaxime 200 mg/l가 첨가된 VWAB 배지에서 재분화를유도하였다.
이 때 기내와 외부 환경과의 습도 및 온도 차이를 고려하여 25±2℃의 배양대에서 유리비커를 이용하여 높은 습도를 유지 시키며 순화기간을 주어 외부환경에 적응할 수 있도록 하였다(Fig. 3e).
1 mg/l, sucrose 30 g/l 처리한 경우 PLB가 안정적으로 증식 되었으며, 위쪽으로부터 1/3지점을 절단하여 계대배양 한 경우 90% 이상의 높은 PLB 증식률을 보였다. 이러한 PLB 증식율을 나타내는 증식체계를 이용하여 gus 유전자를 함유하고 있는 pCAMBIA 1032 벡터를 Agrobacterium 균주 EHA105에 도입하여 이용하여 형질전환 효율을 높이고자 하였다. 그 결과, 접종 시 Agrobacterium 배양액을 농축한 후 날카로운 금속침에 묻혀 PLB를 찔러 감염시키는 dipping 처리 후, Agrobacterium 배양액의 흡광도 값이 0.
그 후 gold 코팅 된 유전자를 Biolistic Particle Delivery System(PDS-1000/He, Bio-rad, USA)을 이용하여 목표 식물체와 microcarrier간의 거리 6 cm, 사출 압력 1,350 psi, vaccum 압력 25 in Hg 하에서 1회 bombardment 후 4주간 PPT-free 배지에서 휴식기간을 주었다. 이후 PPT 5 mg/l가 첨가되어 있는 VWAB 선발 배지에서 12주간 선발 후, 생존 한 PLB만 항생제가 첨가되지 않은 VWAB 배지로 계대하여 재분화를 유도하였다. Agrobacterium 매개법 역시 접종 2일 전 미리 PLB를 준비 한 후, 액체 MS(Table 3)에 희석된 Agrobacterium 균에 20분간 침지하여 접종하였다.
접종한 PLB는 acetosyringone 100 μM이 첨가된 VWAB배지에서 3일간 암조건에서 공동배양 후, 수세배지(Table 1)를 이용하여 수세하였다.

대상 데이터

본 연구진은 변형된 VW배지(VWAB, Table 2)를 이용하였다. PLB는 VW배지 하에서 증식(Fig.
본 연구진은 팔레놉시스의 PLB를 사용하여 particle bombardment 실험과 Agrobacterium을 이용한 실험을 수행하였으며, 형질전환 체의 선발제로서는 PPT를 이용하였고, 단계별 배지 조성은 Table 3과 같다. Particle bombardment를 이용한 형질전환에서 bombardment 전 PLB는 실험 2일 전에 VWAB 배지의 중앙에 직경 3 ~ 4 cm의 원모양으로 치상하여 둔다.

성능/효과

(2009)은 활성탄소, sucrose 및 thiamine 등의 처리를 통해 재분화 효율을 높이고 PLB의 절단면을 다르게 처리하여 절단부위별 PLB의 증식효율을 비교 하였다. 그 결과 Hyponex배지에 활성탄소 1 g/l, thiamine 0.1 mg/l, sucrose 30 g/l 처리한 경우 PLB가 안정적으로 증식 되었으며, 위쪽으로부터 1/3지점을 절단하여 계대배양 한 경우 90% 이상의 높은 PLB 증식률을 보였다. 이러한 PLB 증식율을 나타내는 증식체계를 이용하여 gus 유전자를 함유하고 있는 pCAMBIA 1032 벡터를 Agrobacterium 균주 EHA105에 도입하여 이용하여 형질전환 효율을 높이고자 하였다.
흔히 이용되는 kanamycin을 이용하지 않는 것은 난에는 aminoglycoside계의 선발약제에 대한 내성을 자체적으로 가지고 있어, kanamycin을 이용하여 선발 하는 경우 다른 선발약제에 비해 고농도와 장기간의 선발기간을 요구하기 때문이다. 따라서, 팔레놉시스와 같은 난을 이용한 형질전환 시 선발약제로는 kanamycin보다는 hygromycin이나 PPT를 이용한 선발이 더 효율적이다.
5 mg/lTDZ(Thidiazuron)를 첨가하여 4-6개월 배양하였을 때 100%의 확률로 callus 및 PLBs가 유도 되었다. 또한 1 mg/l NAA와 0.1 mg/l TDZ를 혼용한 처리구에서 가장 많은 수의 PLB 유도를 보였으며, 호르몬이 없는 NDM 배지로 계대배양하였을 때 안정적으로 재분화 되었다. 또한 Khoddamzadeh et al.
3 mg/l TDZ 혹은 5 mg/l BA가 적합하다고 하였다. 또한 Hyponex 4g/l를 기본 배지로 하여 TDZ와 BA의 효과를 비교하였을 때, TDZ가 더 효과적이었으며, 화경의 모든 부위를 절단한 화경절편조직을 배양함으로써 배양재료의 이용을 확대 시켰다. Na et al.
먼저 최적의 형질전환 조건을 알기 위해 고체 혹은 액체 배지에서 선발을 진행하였고, 고체배지에서는 0.5 μM MSO(L-methionin sulfoximine)에서 1개월 배양 후 2 μM MSO 배지로 계대하여 4개월간 배양 시 18.6%의 효율을 보였으며, 액체 배양 시 각각 절반의 농도인 0.2 μM MSO에서 1개월 배양 후 1 μM MSO가 첨가된 배지로 계대 하여 4개월 배양 시 12.7%의 선발 효율을 보였다.
(2012)이 5 mg/l의 낮은 농도의 hygromycin에서 선발한데 반해 20 mg/l hygromycin의 높은 농도에서 선발을 하였다. 목표 유전자인 EgTCTP gene이 포함된 vector를 금입자에 코팅하여 목적조직에 유전자총으로 형질전환 한 후, hygromycin 선발과정을 거친 그룹에서는 93.3%의 GFP 발현율을 보였고 이들의 95.7%의 재분화율을 보여 주었다.

후속연구

팔레놉시스의 형질전환의 경우, 최근 10여 년 동안 10여 편 정도의 연구가 이루어졌지만 대부분이 형질전환 효율성을 높이는 실험이고, 유용유전자 도입에 관한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 좀 더 고효율의 형질전환 팔레놉시스 체계 확립뿐 아니라 유용 유전자가 도입된 형질전환체의 생산과 실용화에 대한 연구와 노력이 필요하다고 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	팔레놉시스란 무엇인가?	꽃은 주로 겨울부터 봄에 개화하는데, 이중에는 여름이나 가을에 개화하는 품종도 있다(강 2001). 팔레놉시스는 전형적인 단경성 난으로 벌브는 없고, 원산지는 히말라야･미얀마･필리핀･태국･인도네시아 등의 동남아시아로 열대아시아에서부터 오스트레일리아까지 넓은 지역에 걸쳐 40 ~ 50종이 분포하고 있으며, 대부분 다습한 지역의 나무에 착생하지만 일부는 바위에 착생하기도 한다(윤과 정 2011).
	PLB의 장점과 단점은 무엇인가?	이러한 형질전환의 효율을 높이기 위해서는 체계화 된 절편체 증식 및 재분화 시스템 구축이 필요한 실정이다. 현재 널리 이용되고 있는 PLB의 경우 급속하게 대량증식을 할 수 있는 유리한 점이 있는 반면 품종에 따라 변이율이 급격히 상승하는 문제점을 가지고 있어 이에 대한 해결책 마련이 시급하다. 팔레놉시스의 형질전환의 경우, 최근 10여 년 동안 10여 편 정도의 연구가 이루어졌지만 대부분이 형질전환 효율성을 높이는 실험이고, 유용유전자 도입에 관한 연구는 미미한 실정이다.
	팔레놉시스 조직배양묘의 문제점은 무엇인가?	조직배양 묘는 실생묘와 비교하여 생육이 비교적 고르고 개화가 거의 동시에 이루어지며 화색과 화형이 동일하여 그 결과 재배에 있어서 용이함과 우수한 상품성을 가지게 된다(김 2010). 그러나, 일부품종에 있어서 변이문제가 발생하여 난 산업에 커다란 걸림돌이 되고 있다. 현재 이를 극복하기 위한 방법으로 난 조직으로부터 직접 다신 초를 유도하는 등의 연구가 진행 중이지만 연구가 부족하고 효율성이 PLB를 통한 증식에 비해 떨어져 아직 우리나라에서는 protocorm-like bodies(PLB)를 통한 클론묘 생산이 주를 이루고 있다(김 2010).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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