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문제 정의
- 본 연구에서는 신경세포사멸 세포모델과 허혈성 뇌졸중 동물모델에서 우슬 물추출물의 신경보호효과를 확인하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 즉, BBB의 손상에 따른 혈장의 유출과 외부 물질의 출입은 조직부종을 발생시키고 결국 관류장애로 인한 뇌혈관 손상과 신경세포로의 산소와 에너지 대사 장애로 이어져 신경세포의 손상과 세포사멸을 유도하게 된다37). 본 연구에서는 우슬 물추출물의 신경보호 효과를 확인하기 위하여 세포배양모델 외 국소뇌허혈 흰쥐 모델을 제작하였으며, 우슬 물추출물의 투여에 의해 뇌경색의 부피가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 혈청 제거‧재관류(serum deprivation‧ reperfusion)를 이용하여 세포사멸이 유도된 PC12 세포에서 우슬 물추출물의 효과를 확인하고, 일시적 국소 뇌동맥 페쇄(transient middle cerebral artery occlusion)에 의해 허혈성 뇌 손상이 유발된 흰쥐에서의 뇌경색 발생에 대한 효과를 확인함으로써 우슬 물추출물의 뇌신경보호효과의 가능성을 평가하고자 수행되었다.
제안 방법
- Probe는 4-0 nylon surgical thread의 한쪽 끝을 가열하여 구형으로 만든 다음 20∼25㎜ 길이로 잘라서 사용하였다. 90분간 결찰(occlusion) 한 후 probe를 제거 하여 24시간 동안 재관류(reperfusion)시켰다. 동물이 마취에서 회복된 다음 Bederson의 방법24)에 따라 꼬리를 중심으로 들었을 때, 몸의 불균형, 앞발의 좌우모양, 왼쪽 선회 등으로 신경학적 행동장애를 측정하였다.
- PC-12 세포에 대한 우슬 추출물의 독성을 평가하기 위해서 여러 농도의 우슬 추출물을 처리하여 24시간 배양한 후 WST-1 assay를 수행하였다. 그 결과, 우슬 추출물(AJN)을 0.
- Sprague Dawley 흰쥐를 80% N2O와 20% O2에 혼합한 1.5% isoflurane으로 흡입하여 마취시키고, 보온패드를 사용하여 체온을 약 37±0.5℃로 유지하면서 중대뇌동맥을 폐색하였다.
- 9% 생리식염수에 녹인 2% 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색약으로 10분간 염색하였다. TTC 용액으로 붉게 염색된 뇌 절편을 4% paraformaldehyde 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒤편 영상을 카메라로 촬영하고 경색면적을 경색을 일으킨 반구의 전체면적에서 염색이 되지 않은 경색면적을 백분율로 나타내어 각 7개의 절편들의 평균을 계산하였다.
- 다음은 세포사멸이 유도된 PC12 세포에서의 우슬추출물의 보호효과를 확인하기 위해서 세포를 혈청 제거 조건으로 12시간 배양한 후 우슬추출물을 0.5, 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하여 세포생존도를 측정하였다. 그 결과, 우슬추출물을 처리한 세포에서 농도 의존적으로 세포생존도가 증가하였으며, 우슬추출물이 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것을 확인하였다(Fig.
- 2%로 측정되어 배양시간에 의존적으로 세포생존도가 감소하였다. 따라서 이후 실험에서는 12시간 혈청 제거 배양 조건으로 수행하였다.
- 우슬추출물이 혈청제거에 따라 세포사멸이 유도된 PC12 세포로부터 발현되는 세포사멸 유도 단백질인 caspase-3의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 먼저, PC12 세포에 독성이 없는 농도범위의 우슬추출물을 2시간 동안 전처리한 다음, 혈청을 제거한 배지로 교체하여 12 시간 배양을 하였다. 각 세포를 수거하여 1× PBS로 3회 씻은 후 lysis buffer(50 mM HEPES, pH 7.
- 또한 우슬의 성분으로서는 oleanolic acid, saponin, metamorphosis hormone, inokosterone, ecdysone, polysaccharide, 20-hydroxyecdysone, steroid 계열인 β-sitosterol, stigmasterol, rubrosterone 등이 보고되어 있다20,21). 본 연구에서는 쇠무릎(Achyranthes japonica)의 물 추출물을 제조하여 PC-12 세포에서 혈청 제거에 의한 세포사멸에 대한 보호효과와 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈성 뇌손상 유발 흰쥐의 뇌 조직에서의 뇌경색 발생 억제 효과를 검증함으로써 우슬의 뇌신경보호효과를 확인하였다.
- 실험동물을 대조군(vehicle)과 실험군(sample group)으로 나누고, 실험군은 다시 서로 다른 농도(50, 100, 200㎎/㎏)의 우슬추출물을 경구 투여 한 군으로 나누었으며, 대조군은 약물 대신 1× PBS를 투여하였다.
- 우슬 건조약재에 10배량의 1차 증류수를 가하여 환류냉각기를 장치하고 히팅맨틀(heating mantle)을 이용해 2시간 동안 열탕한 후 전액을 3겹 거어즈와 와트만 여과지로 여과하였다. 잔류물을 다시 같은 방법으로 2차 추출하였으며, 1,2차 추출액을 혼합하여 동결건조기(Bondiro, Ilshin Lab, Korea)에서 동결건조함으로써 우슬의 물추출물 건조분말을 얻었다.
- 우슬추출물에 의한 세포독성과 세포사멸 유도 후 세포생존도 변화에 대한 효과를 확인하기 위해서 WST-1 assay를 수행하였다. 먼저 6-well plate에 세포(3×105 cell/well)를 분주하여 하룻밤 배양한 후 우슬추출물 0.
- 우슬추출물의 세포사멸에 대한 보호효과를 바탕으로 허혈성 뇌졸중에 대한 개선 효과를 확인하기 위해 중대뇌동맥 폐쇄(occlusion 90 min, reperfusion 24 hr)로 허혈성 손상이 유발된 흰쥐에 우슬추출물을 50, 100, 200 ㎎/㎏ 용량으로 단회 투여 후 뇌 조직을 적출하여 TTC 염색으로 뇌경색의 부피를 측정하였다. 그 결과, 허혈 유발군(vehicle)은 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈성 손상으로 뇌경색이 발생함으로써 뇌경색 부피가 29.
- 우슬 건조약재에 10배량의 1차 증류수를 가하여 환류냉각기를 장치하고 히팅맨틀(heating mantle)을 이용해 2시간 동안 열탕한 후 전액을 3겹 거어즈와 와트만 여과지로 여과하였다. 잔류물을 다시 같은 방법으로 2차 추출하였으며, 1,2차 추출액을 혼합하여 동결건조기(Bondiro, Ilshin Lab, Korea)에서 동결건조함으로써 우슬의 물추출물 건조분말을 얻었다. 이때 우슬 물추출물의 수득률은 건조약재 대비 50.
- 중대뇌동맥 폐색 24시간 경과 후 흰쥐를 1.5% isoflurane으로 흡입 마취시킨 다음 뇌를 적출하고 뇌 주형틀을 이용하여 frontal pole에서 2 ㎜ 두께로 잘라 7개의 뇌 관측 절편을 만들어 0.9% 생리식염수에 녹인 2% 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색약으로 10분간 염색하였다. TTC 용액으로 붉게 염색된 뇌 절편을 4% paraformaldehyde 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒤편 영상을 카메라로 촬영하고 경색면적을 경색을 일으킨 반구의 전체면적에서 염색이 되지 않은 경색면적을 백분율로 나타내어 각 7개의 절편들의 평균을 계산하였다.
- 5℃로 유지하면서 중대뇌동맥을 폐색하였다. 즉 마취하에서 목의 정중선을 따라 경부를 절개하고 미주신경에 손상을 주지 않도록 주의하면서 좌측 총경동맥 (Common carotid artery CCA), 내경동맥(Internal carotid artery ICA), 외경동맥(External carotid artery ECA)을 분리한 다음, 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥 내로 probe를 삽입하고 그 바로 위쪽을 결찰하였다. Probe는 4-0 nylon surgical thread의 한쪽 끝을 가열하여 구형으로 만든 다음 20∼25㎜ 길이로 잘라서 사용하였다.
- 즉, 6-well plate에 PC12 세포(3×105 cell/well)를 분주하여 하룻밤 배양한 후 다음 날 완전 배지를 모두 제거하고 혈청이 제거된 배지(serum free media)로 교환한 후 5% CO2 상태에서 6 시간 또는 12시간 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 medium, fetal bovine serum(FBS), horse serum, penicillin-streptomycine(P/S) 등 세포배양 시약은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 WST-1 reagent는 Roche (indianapolis, IN, USA)사에서, anti-caspase-3 monoclonal antibody(mAb)는 Cell signaling(MA, USA)사에서, goat antirabbit, goat anti-mouse mAb는 각각 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다. 또한 X-ray film(Kodak Co, Ltd, Burnaby, BritishColumbia), ECL solution(PIerce Co, IL, USA), protein assay solution(BioRad Laboratories, Inc, CA, USA), 3-(4,5-dimethy lthazol-2-yl-2,5-teterazolium bromide Sigma, St Louis, CA, USA)을 사용하였으며, 기타 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 우슬은 한국 전남 영암군의 쇠무릎(Achyranthes japonica Nakai； AJN)을, ㈜광명당제약(울산, 한국)에서 제약화 한 것을 구입하여 관능검사 후 제조한 물추출물을 한국한의학연구원(KIOM)으로부터 제공받아 사용하였다. 약재 표본은 한국한의학연구원에 보관하였다(표본번호 KIOM010079).
- 흰쥐의 pheochromocytoma 세포인 PC-12 세포는 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO2, 95% air 조건에서 5% horse serum, 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 RPMI1640 배지를 배양액으로 하여 배양하였으며, 이때 poly-L-lysine (Sigma, Saint Louis, MO, USA)으로 코팅된 배양 용기를 이용하였다.
데이터처리
- 모든 결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)±표준오차(standard error；SE)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 GraphPad Prism program의 Student t-test를 수행하여 p 값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 5 and 1 ㎎/㎖ for 24 hr. Cell viability was determined by WST-1 assay. Values are means±SE of three indifferent experiments.
- 세포사멸을 유도하기 위해 이전에 보고되었던 방법22)인 혈청제거(serum-deprivation) 및 재관류(reperfusion) 방법을 사용하였다. 즉, 6-well plate에 PC12 세포(3×105 cell/well)를 분주하여 하룻밤 배양한 후 다음 날 완전 배지를 모두 제거하고 혈청이 제거된 배지(serum free media)로 교환한 후 5% CO2 상태에서 6 시간 또는 12시간 배양하였다.
- 우슬추출물이 혈청제거에 따라 세포사멸이 유도된 PC12 세포로부터 발현되는 세포사멸 유도 단백질인 caspase-3의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 먼저, PC12 세포에 독성이 없는 농도범위의 우슬추출물을 2시간 동안 전처리한 다음, 혈청을 제거한 배지로 교체하여 12 시간 배양을 하였다.
- 혈청 제거에 의해 세포사멸이 유도된 PC12 세포에서 세포사멸 유도 단백질인 caspase-3의 발현에 대한 우슬 추출물의 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 그 결과, 정상세포는 capsase-3의 발현이 낮게 나타났으며, 혈청제거에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서 현저히 증가되었다(Fig.
성능/효과
- 1. 우슬추출물은 PC-12 세포에서 혈청제거로 인한 세포사멸로부터 세포증식을 유도하였다.
- 2. 우슬추출물은 PC-12 세포에서 세포사멸에 따른 caspase-3 발현 증가를 유의적으로 억제하였다.
- 3. 우슬추출물은 허혈성 뇌졸중 흰쥐에서 뇌경색의 부피를 유의적으로 감소시켰다.
- 그 결과, 우슬 추출물(AJN)을 0.1, 0.5, 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 세포 생존도는 각각 98.33±3.08%, 96.25±4.33%, 93.77±3.95%, 96.52±2.99으로 측정되어 우슬 추출물은 PC12 세포에서 1 ㎎/㎖농도까지 독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- 5, 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하여 세포생존도를 측정하였다. 그 결과, 우슬추출물을 처리한 세포에서 농도 의존적으로 세포생존도가 증가하였으며, 우슬추출물이 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 혈청 제거에 의해 세포사멸이 유도된 PC12 세포에서 세포사멸 유도 단백질인 caspase-3의 발현에 대한 우슬 추출물의 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 그 결과, 정상세포는 capsase-3의 발현이 낮게 나타났으며, 혈청제거에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서 현저히 증가되었다(Fig. 4). 또한 혈청 제거로 증가된 caspase-3 단백질의 발현은 우슬 추출물을 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 유의적으로 감소하였다.
- 그 결과, 허혈 유발군(vehicle)은 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈성 손상으로 뇌경색이 발생함으로써 뇌경색 부피가 29.72±12.7%로 측정되었으며, 허혈 유발 후 우슬추출물을 투여한 군에서는 50, 100, 200 ㎎/㎏ 용량에서 각각 27.74±5.26%, 24.95±13.74%, 22.83±8.98%로 측정되어 100, 200 mg/kg 투여군에서 유의적으로 뇌경색 부피가 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 따라서 우슬은 신경세포 사멸을 막고, 허혈성 손상에 따른 뇌경색 발생을 감소시킴으로써 뇌 신경보호 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 4). 또한 혈청 제거로 증가된 caspase-3 단백질의 발현은 우슬 추출물을 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 유의적으로 감소하였다.
- 본 연구에서는 혈청을 제거한 배양 조건으로 12시간 배양함으로써 PC12 세포의 세포사멸을 유도하였으며, 혈청 제거로 인해 세포 생존도가 감소하고 세포 형태가 변형되었으며 caspase-3 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 우슬 물추출물의 세포사멸로 인한 세포생존도 감소를 증가시키고 caspase-3의 발현을 억제시킴으로써 세포사멸로부터 보호하는 것으로 나타났다.
- 먼저 PC12 세포에서 혈청 제거로 인한 유도되는 세포 생존율의 감소를 확인하기 위해서 세포를 혈청 제거 조건에서 6시간과 12시간 배양한 후 WST-1 assay를 수행하였다, 그 결과, 혈청이 제거 되지 않은 정상세포에서는 세포생존율이 6시간에 다소 증가하였으나, 12 시간이 지난 후에는 일정하게 유지되었다(Fig. 2). 그러나 혈청을 제거한 세포사멸 유도 세포에서의 세포생존율은 6시간에는 64.
- 또한 PC-12 세포는 신경세포사멸 연구에 매우 유용한 세포배양모델로서 소 태아 혈정(fetal bovine serum)의 농도가 세포사멸 조건을 결정하는데 중요하게 작용하기 때문에 혈청을 제거한 배양조건으로 쉽게 세포사멸을 유도할 수 있으며, 배양액 내 소태아혈청의 농도는 세포사멸 조건을 결정하는데 중요하게 작용하고, Bcl-x, Bax, caspase-3 등과 같은 세포사멸 조절 단백질들을 활성을 측정할 수 있다27,28). 본 연구에서는 혈청을 제거한 배양 조건으로 12시간 배양함으로써 PC12 세포의 세포사멸을 유도하였으며, 혈청 제거로 인해 세포 생존도가 감소하고 세포 형태가 변형되었으며 caspase-3 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 우슬 물추출물의 세포사멸로 인한 세포생존도 감소를 증가시키고 caspase-3의 발현을 억제시킴으로써 세포사멸로부터 보호하는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로부터 우슬 물추출물은 혈청을 제거를 통해 세포사멸이 발생한 PC12 세포에서 세포증식을 유도하고, caspase-3의 발현을 억제시킴으로써 세포를 보호하였으며, 중뇌동맥 폐쇄로 인한 허혈성 뇌졸중 유발 흰쥐에서 뇌경색의 부피를 감소시킴으로써 뇌조직을 보호하는 것으로 나타났다.
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