본 연구에서는 대장염 유발균인 C, difficile에 대한 항균활성이 우수한 천연항균물질을 검색하기 위하여 40여 가지 생약재 에탄올 추출물에 대하여 C. difficile에 대한 생육저해활성을 측정하였다. 결과, 우슬, 희첨, 황백은 1,000 ppm농도에서 90% 이상의 높은 항균 활성을 나타내었고, 우슬 에틸아세테이트분획물(AJNEA)은 가장 높은 활성을 나타내었으며 이의 최소저해농도(MIC)는 $625{\mu}g/mL$였다. 또한 기능성 소재로의 활용가능성을 확인하기 위하여 AJNEA의 유산균 생육에 미치는 영향을 조사한 결과, B. longum, L. helveticus와 S. thermophilus를 제외한 나머지 균주들에 대해서 생장 억제 효과를 나타내지 않았다. 이들 결과로부터 우슬 추출물은 C. difficile 관련 질환에 대하여 우수한 항균제제로 이용될 수 있을 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 대장염 유발균인 C, difficile에 대한 항균활성이 우수한 천연항균물질을 검색하기 위하여 40여 가지 생약재 에탄올 추출물에 대하여 C. difficile에 대한 생육저해활성을 측정하였다. 결과, 우슬, 희첨, 황백은 1,000 ppm농도에서 90% 이상의 높은 항균 활성을 나타내었고, 우슬 에틸아세테이트분획물(AJNEA)은 가장 높은 활성을 나타내었으며 이의 최소저해농도(MIC)는 $625{\mu}g/mL$였다. 또한 기능성 소재로의 활용가능성을 확인하기 위하여 AJNEA의 유산균 생육에 미치는 영향을 조사한 결과, B. longum, L. helveticus와 S. thermophilus를 제외한 나머지 균주들에 대해서 생장 억제 효과를 나타내지 않았다. 이들 결과로부터 우슬 추출물은 C. difficile 관련 질환에 대하여 우수한 항균제제로 이용될 수 있을 것으로 확인되었다.
In this study, the ethanolic extracts of 40 species of traditional herbal medicines were examined for their antimicrobial activities against Clostridium difficile. Among the 43 screened traditional herbal medicines, Achyranthes Japonica Nakai (AJN), Siegesbeckia glabrescens Makino, and Phelloedendro...
In this study, the ethanolic extracts of 40 species of traditional herbal medicines were examined for their antimicrobial activities against Clostridium difficile. Among the 43 screened traditional herbal medicines, Achyranthes Japonica Nakai (AJN), Siegesbeckia glabrescens Makino, and Phelloedendron amurense Ruprecht showed antimicrobial activities greater than 90% at a concentration of 500 ppm. According to the minimum inhibitory concentration (MIC) test the ethyl acetate soluble fraction of the AJN ethanolic extracts (AJNEA) showed the highest growth inhibitory activity against C. difficile, with a MIC of $625{\mu}g/mL$. In addition, the effect of AJNEA on the growth of lactic acid bacteria was investigated. AJNEA did not inhibit the growth of the tested Bifidobacterium spp. or Lactobacillus spp., with the exception of B. longum, Streptococcus thermophilus, and L. helveticus. These results indicate that AJNEA can be utilized as a potential antimicrobial agent against C. difficile related disease.
In this study, the ethanolic extracts of 40 species of traditional herbal medicines were examined for their antimicrobial activities against Clostridium difficile. Among the 43 screened traditional herbal medicines, Achyranthes Japonica Nakai (AJN), Siegesbeckia glabrescens Makino, and Phelloedendron amurense Ruprecht showed antimicrobial activities greater than 90% at a concentration of 500 ppm. According to the minimum inhibitory concentration (MIC) test the ethyl acetate soluble fraction of the AJN ethanolic extracts (AJNEA) showed the highest growth inhibitory activity against C. difficile, with a MIC of $625{\mu}g/mL$. In addition, the effect of AJNEA on the growth of lactic acid bacteria was investigated. AJNEA did not inhibit the growth of the tested Bifidobacterium spp. or Lactobacillus spp., with the exception of B. longum, Streptococcus thermophilus, and L. helveticus. These results indicate that AJNEA can be utilized as a potential antimicrobial agent against C. difficile related disease.
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문제 정의
difficilee 대한 생장 억제 활성을 측정하였다. 또한 장내 유익균인 유산균의 생육에 미치는 영향을 조사함으로서 새로운 C. difficile 치료제 또는 기능성 소재로서의 개발 가능성을 확인하였기에 보고하고자 하였다.
본 연구에서는 대장염 유발균인 C. difficilee 대한 항균 활성이 우수한 천연항균물질을 검색하기 위하여 40여 가지 생약재 에탄올 추출물에 대하여 C. difficile 대한 생육저해활성을 측정하였다. 결과, 우슬, 희첨, 황백은 1,000 ppm 농도에서 90% 이상의 높은 항균 활성을 나타내었고, 우슬 에틸아세테이트분획물(AJNEA) 은 가장 높은 활성을 나타내었으며 이의 최소저해농도(MIC)는 625 pg/mL였다.
본 연구에서는 문헌조사를 통해 항염증 및 항균 효과가 알려진 40여 가지의 생약재를 선정하여 대장염의 원인균인 C. difficile 에 대한 항균활성을 조사하였고, 가장 높은 항균활성을 나타낸우슬에 대하여 C. difficilee 대한 생장 억제 활성을 측정하였다. 또한 장내 유익균인 유산균의 생육에 미치는 영향을 조사함으로서 새로운 C.
제안 방법
3이 되도록 희석하여 100 |iL 도말 후 membrane syringe filter로 제균한 시료를 원통에 100 pL 흡수시켰다. 37℃ incubator에서 12-24시간 배양 후 원통(직경 7mm) 주위에 형성된 억제환의 크기에 따라 항균활성을 비교하였다(17).
각각의 시료 50 g에 10배 용량의 95% 에탄올을 가하여 침지한 뒤, 24시간 동안 정지추출하고, 이를 총 3회 반복하여 추출하였다. 주줄액은 여과지 (Whatman No.
difficile에 대한 우슬 주줄물의 최소저해 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)는 액체배지희석법에 의하여 측정하였다. 각각의 시료를 첨가하여 배양된 액체배지로부터 500씩 취해서 agar plate에 접종한 후 균의 생육을 확인하였고, 균이 생성되지 않은 최소 농도를 MIC로 하였다.
difficilee 의한 위막성대장염에 사용되고 있다. 본 연구에 사용된 vancomycin의 유효최저혈청농도는 5- 12ug/mL이고, 유효최고혈청농도는 25-40 ml로 이 농도를 기준으로 12.5 /mL을 처리 농도를 하였다. Kim 등(14)은 우슬이다양한 진균성 식물병해들에 대하여 항진균력을 보인다고 보고한 바 있으나 아직까지 항생제 내성균주에 대해서는 보고된 바는 없다.
유산균에 대한 증식활성은 각각의 유산균을 10mL TPY 또는 MRS 액체배지에 1% 접종하고 우슬의 에틸아세테이트분획물을 membrane syringe filter로 제균한 후 500 ppm의 농도로 처리하여 37℃ incubatoi에서 18시간 배양한 후 O.D.(600nm)를 측정하였다.
difficile 치료제 또는 기능성 소재로서의 개발 가능성을 확인하기 위해서 장내 유익 균총인 Bifidobacterium spp와 Lactobacillus spp.의 생육에 미치는 영향을 조사하였다(Fig.3). 우슬 에틸아세테이트분획물은 실험에 사용한 균주 중 B.
, Kent, UK)를 사용하여 여과하였고, 감압농축기 (EYELA, Tokyo, Japan) 를 사용하여 감압 농축한 후 건조하여 냉동 보관하면서 활성 검증을 위한 에탄올 추출물 시료로 사용하였다. 이 에탄올 조추출물(44.67 g)을 증류수에 현탁시 킨 후 ”-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 및 water 순으로 분획을 실시하였고, 얻어진 각각의 분획은 감압 농축 한 후 건조하여 시료로 사용하였다. 에탄올 추출물로부터 얻어진 각각의 용매별 분획물의 함량은 헥산층
항균활성이 우수한 우슬, 희첨, 황백의 에탄올 추출물에 대하여 극성에 따른 용매분획을 실시하였다. 각각의 분리된 분획물 (500ppm)에 대하여 액체배지희석법에 의해 C.
대상 데이터
rhamnosus GG IFO 3863을 사용하였다. C. difficile의 전배양 및 본배양을 위한 생육배지는 reinforced clostridial medium(RCM) 액체배지 (Dili:, Detroit, MI, US A)를 사용하였으며 , 평 판배지 로 brucella agar with hemin/vitamin KI (BA, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. Bifidobacterium spp.
는 trypticase-proteose peptone-yeast extract(TPY) 액체배지를 사용하였고, Lactobacillus spp.는 Lactobacilli MRS broth(Difco)를 사용하였다.
황백은 헥산분획물을 제외한 나머지 용매 분획물에서 60% 이상의 활성을 나타내었으나 물 분획물에서는 활성을 보이지 않았다. 따라서 우슬 에틸아세테이트 분획물을 C. difficile에 대한 최종 항균활성시료로 선정하였다.
본 실험에 사용한 40여 가지의 생약재는 서울 경동시장 약재 상가에서 구입하였으며, 건조 및 마쇄하여 시료로 사용하였다. 시료 추출에 사용한 용매는 일급 또는 특급을 사용하였다.
본 실험에 사용한 C. difficile ATCC 9689는 한국 미생물 보존센터 (KCCM, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 유산균은 본 실험실에서 보유하고 있던 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703, B.
difficile ATCC 9689는 한국 미생물 보존센터 (KCCM, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 유산균은 본 실험실에서 보유하고 있던 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703, B. bifidum ATCC 29521, B. breve ATCC 15700, B. infantis ATCC 15697, B. longum ATCC 15707, Lactobacillus brevis ATCC 14869, L. bulgaricus CH-2, L. helveticus ATCC 15009와 Denmark의 C.H.R. Hansen's 실험실에서 분양 받은 Staphylococcus thermophilus KCTC 21185, KCCM에서 분양받은 L. acidophilus ATCC 4356, L. rhamnosus GG IFO 3863을 사용하였다. C.
뒤, 24시간 동안 정지추출하고, 이를 총 3회 반복하여 추출하였다. 주줄액은 여과지 (Whatman No. 2, Whatman Ltd., Kent, UK)를 사용하여 여과하였고, 감압농축기 (EYELA, Tokyo, Japan) 를 사용하여 감압 농축한 후 건조하여 냉동 보관하면서 활성 검증을 위한 에탄올 추출물 시료로 사용하였다. 이 에탄올 조추출물(44.
시료 추출에 사용한 용매는 일급 또는 특급을 사용하였다. 항생제로는 CJ 제약(Seoul, Korea)의 vancomycin-HCl을 구입하여 대조군으로 사용하였다.
이론/모형
C. difficile에 대한 우슬 주줄물의 최소저해 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)는 액체배지희석법에 의하여 측정하였다. 각각의 시료를 첨가하여 배양된 액체배지로부터 500씩 취해서 agar plate에 접종한 후 균의 생육을 확인하였고, 균이 생성되지 않은 최소 농도를 MIC로 하였다.
성능/효과
40여종의 생약재 에탄올 추출물의 C. difficile에 대한 항균 활성을 검색한 결과, 우슬(Achyramhes japonica Nakai, AJN), 희첨 (Siegesbeckia glabrescens Makino), 황백 (Phelloedendron amurense Ruprecht)은 1,000 ppm 농도에서 90% 이상의 높은 활성을 보였고, 지각(C&s aurantium L.), 길경 (Platycodon grandiflorum ADC) 등은 50% 이상의 활성을 나타내었으며, 위령선(Clematis mandshurica Rupr), 산사(Gwlaegits pinnatifida Bunge), 인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer), 금은회-(Zocera japonica Thun- beis) 등은 C. difficile 대한 항균활성을 보이지 않았다(Table 1). 각각의 추출물은 C.
2), 12시간까지 그 저해 활성이 가장 높았고, 20시간까지도 유지되면서 우수한 효과를 나타내었다. AJNEA(500ppm)는 L. rhamnosus GG(100ppm) 보다는 높은 생장억제 활성을 나타내었으나 vanco-mycins(12.5 ppm)과 유사한 높은 효과를 보였다. 우슬 에틸아세테이트분획물의 유산균에 대한 생육 증식 효과우슬의 새로운 C.
극성에 따른 용매분획을 실시하였다. 각각의 분리된 분획물 (500ppm)에 대하여 액체배지희석법에 의해 C. difficile 대한 생육 억제 활성을 측정한 결과 (Fig. 1), 우슬 에틸아세테이트분획 물에서 95%로 가장 높은 항균력을 나타냈으며, 희첨의 클로로포름분획 물에서는 80% 이상을 나타내었다. 황백은 헥산분획물을 제외한 나머지 용매 분획물에서 60% 이상의 활성을 나타내었으나 물 분획물에서는 활성을 보이지 않았다.
difficile 대한 항균활성을 보이지 않았다(Table 1). 각각의 추출물은 C. difficile에 대하여 12시간 배양하였을 때 가장 높은 항균효과를 나타내었다(data not shown). Cai 등(18)은 Staphylococcus 와 Escherichia coli O157:H7에 대한 우슬, 목단피, 지실, 황백 등의 항균 활성을 보고하였고, Park 등(19)은 황백 추출물의 L.
difficile 대한 생육저해활성을 측정하였다. 결과, 우슬, 희첨, 황백은 1,000 ppm 농도에서 90% 이상의 높은 항균 활성을 나타내었고, 우슬 에틸아세테이트분획물(AJNEA) 은 가장 높은 활성을 나타내었으며 이의 최소저해농도(MIC)는 625 pg/mL였다. 또한 기능성 소재로의 활용가능성을 확인하기 위하여 AJNEA의 유산균 생육에 미치는 영향을 조사한 결과, B.
결과, 우슬, 희첨, 황백은 1,000 ppm 농도에서 90% 이상의 높은 항균 활성을 나타내었고, 우슬 에틸아세테이트분획물(AJNEA) 은 가장 높은 활성을 나타내었으며 이의 최소저해농도(MIC)는 625 pg/mL였다. 또한 기능성 소재로의 활용가능성을 확인하기 위하여 AJNEA의 유산균 생육에 미치는 영향을 조사한 결과, B. longum, L. heZveticns와 S. thermophilus를 제외한 나머지 균주들에 대해서 생장 억제 효과를 나타내지 않았다. 이들 결과로부터우슬 추출물은 C.
우슬 에틸아세테이트분획물의 첨가농도에 따른 항균활성을 측정한 결과 2가지 방법에서 모두 농도 의존적으로 높은 항균 활성을 나타내었으며(Table 2), . 500 ppm의 농도에서는 현재 CDAD 치료에 사용되고 있는 vancomycin(12.
salivariuse- 동정한 법}- 있다. 이미 활성이 알려진 L rhamnosus GG 균주배양액 또는 우슬 에틸아세테이트분획물 시료를 첨가하여 배양한 C. difficile을 20시간 배양 동안 4시간 간격으로 생장 정도를 확인한 결과(Fig. 2), 12시간까지 그 저해 활성이 가장 높았고, 20시간까지도 유지되면서 우수한 효과를 나타내었다. AJNEA(500ppm)는 L.
후속연구
plantarum 및 Leuconostoc mesenteroides에 대한 항균 효과를 보고한 바 있다. 그러나 우슬, 황백 및 희첨의 C. difficile에 대한 생육 억제 활성에 대한 연구는 보고된 바 없어, 이들의 CDAD 관련 치료제로서의 개발 가능성을 확인하였고, 가장 높은 항균활성을 나타낸 추출물을 최종 시료로서 사용하였다.
(121%)와 Streptococcus 25%)에 대해서 약간의 생육 저해활성을 보였다. 따라서 우슬은 이들 probiotics 균주들의 생육에는 영향을 미치지 않으면서 C. difficilee 대한 항균-상승효과(synergistic antimicrobial effect)를 나타낼 것으로 사료되어 이에 대한 추가 실험을 진행 중이며, 이들 결과로부터 우슬추출물의 CDAD 관련 질환에 대한 치료제제 또는 기능성 소재로서 활용가능성을 확인하였다.
thermophilus를 제외한 나머지 균주들에 대해서 생장 억제 효과를 나타내지 않았다. 이들 결과로부터우슬 추출물은 C. difficile 관련 질환에 대하여 우수한 항균제 제로 이용될 수 있을 것으로 확인되었다.
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