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문제 정의
- 이들은 사람과 환경 내에 많이 분포하고 환경의 변화에 안정하여 지표미생물로의 기본 조건을 충족시키며 오염원에 대한 특이성을 가지고 있어 수질을 평가하는데 널리 이용되고 있다[5,14]. 본 연구에서는 제주도의 제주시에 해안에서 용출되는 용천수에서 미생 물학적인 수질오염의 평가와 비교를 통하여 차후 제주도 용천수의 보전 및 관리를 위한 기초자료로서 이용하고자 한다.
- 인구의 증가와 생활수준의 발달로 인한 생활 쓰레기 및 원예작물들의 생산성을 증대하기 위한 화학 비료와 축산 폐기물등의 오염원증가에 따른 수질오염 등으로 음용수로 쓰이는 지하수에 대한 중요성이 부각되고 있으며, 이러한 수질오염을 평가하는데 있어서 미생물지표를 이용하여 수질을 관리하고 평가하는 연구가 오래 전부터 시도되어왔고, 이미 세계 각국 은 오염 정도를 파악할 수 있는 기준을 마련하고, 정확한 수질 관리를 위한 연구를 진행하고 있다. 호소수질환경기준에는 총대장균과 분원성 대장균군이 포함되어 있다[3,9].
제안 방법
- coli O157:H7의 선택배지인 MacConkey sorbitol agar (BD, USA)에 접종하여 도말한 후 37℃에서 24시간 배양한 후, Sorbitol을 분해하지 못하는 white colony를 선별하여 실험에 사용하였으며, 확정 시험은 Eosin methylene blue agar (EMB agar, BD, USA)를 사용하여 확인하였다. EMB agar에서 의심되는 균주는 Gram staining, Triple sugar iron agar (TSI agar, BD, USA) test, Indole, Methyl red, Voges proskayer, Citrate utilization (IMViC) test, Lysine decarboxylase, Motility test를 실시하여 동정하였다. 최종 분리된 균은 API 20E kit (BioMerieux, France)를 사용하여 확정 시험을 측정 실시하였다[7].
- 증균 배양액을 Xylose lysine deoxycholate (XLD agar, BD, USA)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 의심되는 집락은 확인 시험을 실시하였다. TSI 사면 배지의 사면과 고층부에 접종하고 35℃에서 18~24시간 배양하여 생물학적 성상을 검사 하였으며, 살모넬라는 유당, 서당 비분해(사면부 적색), 가스생성(균열 확인) 양성인 균에 대하여 그람음성 간균임을 확인하고 urease 음성, Lysine decarboxylase 양성의 특성을 확인 하였다.
- 단계적으로 희석 되어진 용천수 시료를 EC broth (BD, USA)에 접종하여 37℃의 Water bath (JEIO TECH, Korea)에서 24시간의 증균 과정을 거친 후 E. coli O157:H7의 선택배지인 MacConkey sorbitol agar (BD, USA)에 접종하여 도말한 후 37℃에서 24시간 배양한 후, Sorbitol을 분해하지 못하는 white colony를 선별하여 실험에 사용하였으며, 확정 시험은 Eosin methylene blue agar (EMB agar, BD, USA)를 사용하여 확인하였다. EMB agar에서 의심되는 균주는 Gram staining, Triple sugar iron agar (TSI agar, BD, USA) test, Indole, Methyl red, Voges proskayer, Citrate utilization (IMViC) test, Lysine decarboxylase, Motility test를 실시하여 동정하였다.
- 5℃의 배양기 에서 48시간동안 배양하며 24시간마다 관찰 및 발효관에 가스가 관찰시에는 확정 판단하였다. 대장균군수는 MPN/100 ml의 단위로 측정하고 기하평균(GEOMEAN) 값으로 산출하였다[2,7].
- 2℃ water bath에서 24±2시간 배양하여 발효관에 가스가 관찰 시에는 확정 판단하였다. 분변계 대장균군수는 BGLB 및 EC broth에서 모든 시험관이 가스양성을 나타내는 희석에서부터 3단계를 선택하여 MPN/100 ml의 단위로 측정하고 기하평균(GEOMEAN) 값으로 산출하였다[2,7].
- 85% 생리식염수에 단계별로 희석하여, PCA (Plate counter agar, BD, USA) 배지 양 15 ml를 무균적으로 분주 하였다. 분주시 페트리 접시 뚜껑에 희석된 시료가 부착하지 않도록 주의 하며 회전하여 냉각 응고한 후 다시 중층하여 시료가 분주된 페트리 접시를 거꾸로 하여 25℃배양기에서 24시간 배양한 후 생성된 일반세균을 측정 하였다[2].
- 용천수 시료를 MacConkey agar (BD, USA)에 도말 후 24시간 동안 배양 후 관찰하여 무색 투명하게 자란 유당 비분해 집락을 선택하여, 감별 배지인 Triple sugar iron agar 에서 확인한 후 API 20E kit에 접종하여 37℃에서 18~24 시간 배양하여 당과 효소, 기질에 대한 생화학적 성상을 검토 후 동정하였다.
- 용천수 시료를 증균용 액체배지인 Alkaline peptone water에 37℃에서 24시간 증균 배양하고 선택배지인 TCBS (BD, USA)배지에 도말하여 청녹색 단일 집락을 확인한 후 확인시험은 선택배지 상에서 의심되는 집락을 선택하여 Triple sugar iron agar (BD, USA)에서 확인한 후 API 20NE kit을 이용하여 동정하였다[7].
- 음용수 및 식품 일반에 대한 미생물 규격(수질오염공정시험기준, 식품공전)에서 정하고 있는 식중독 균을 포함한 총 6종의 미생물(일반세균, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Stapylococcus aureus) 을 검사하였다. 총 21곳의 용천수를 대상으로 2010년 1월부터 4월까지 월별 모니터링을 한 결과를 Table 3-6에 나타내었다.
- 1 ml를 취하여 10 ml의 Rappaport-Vassiliadis배지에 접종하여 42℃에서 24±2시간 배양하였다. 증균 배양액을 Xylose lysine deoxycholate (XLD agar, BD, USA)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 의심되는 집락은 확인 시험을 실시하였다. TSI 사면 배지의 사면과 고층부에 접종하고 35℃에서 18~24시간 배양하여 생물학적 성상을 검사 하였으며, 살모넬라는 유당, 서당 비분해(사면부 적색), 가스생성(균열 확인) 양성인 균에 대하여 그람음성 간균임을 확인하고 urease 음성, Lysine decarboxylase 양성의 특성을 확인 하였다.
- 채취한 용천수 시료 1 ml를 9 ml의 멸균된 0.85% 생리식염수에 단계별로 희석하여, PCA (Plate counter agar, BD, USA) 배지 양 15 ml를 무균적으로 분주 하였다. 분주시 페트리 접시 뚜껑에 희석된 시료가 부착하지 않도록 주의 하며 회전하여 냉각 응고한 후 다시 중층하여 시료가 분주된 페트리 접시를 거꾸로 하여 25℃배양기에서 24시간 배양한 후 생성된 일반세균을 측정 하였다[2].
- EMB agar에서 의심되는 균주는 Gram staining, Triple sugar iron agar (TSI agar, BD, USA) test, Indole, Methyl red, Voges proskayer, Citrate utilization (IMViC) test, Lysine decarboxylase, Motility test를 실시하여 동정하였다. 최종 분리된 균은 API 20E kit (BioMerieux, France)를 사용하여 확정 시험을 측정 실시하였다[7].
- 추정시험에서 가스가 생성 된 것을 EC (EC broth, BD, USA) 배지에 접종한 후44.5±0.2℃ water bath에서 24±2시간 배양하여 발효관에 가스가 관찰 시에는 확정 판단하였다.
- 확정시험은 BGLB (brilliant green lactose bile broth, BD, USA)에 접종하여 35.0±0.5℃의 배양기 에서 48시간동안 배양하며 24시간마다 관찰 및 발효관에 가스가 관찰시에는 확정 판단하였다.
대상 데이터
- 1. Location of the sample site (black square) in Jeju-city, Korea.
- 본 연구에서 현장조사 및 시료채취는 2010년 1월, 2월, 3월, 4월에 실시하였으며, 조사 정점은 제주도내 제주시 해안가에 위치한 용천수 지역을 조석간만의 차이에서 간조 시 해수와 혼합이 적고 채집이 용이한 21개 지점을 선정하였다(Fig. 1). 수온 및 염분, pH는 YSI 600QS를 이용하여 현장에서 측정하였으며, 용존산소(DO)는 현장에서 DO meter를 사용하여 측정하는 방법과 산소병에 고정하여 실험실로 옮긴 후 Winkler-Azide 방법을 병행하여 측정하였다[12].
이론/모형
- 본 연구에 사용한 대장균 검사는 미국 APHA의 Recommended Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish [2]의 방법인 MPN법(Most Probable Number Method)에 따라 추정시험은 용천수 시료 10 ml와 PBS 10 ml를 1:1비율, 시료 1 ml에 PBS 9 ml의 양으로 혼합한 후, 시료가 잘 섞이게 한 후, 15 ml 시험관에 분주된 LST (lauayl tryptose broth, BD, USA)배지를 사용하여 배지10 ml에 희석된 시료를 접종 후 35±0.5℃에서 24±2 시간 배양 하고 24시간 단위로 가스 생성을 관찰, 가스가 생성되지 않으면 24시간 추가배양하고 가스가 생성된 것은 추정시험 양성으로 기록하고 확정시험을 실시하였다.
- 1). 수온 및 염분, pH는 YSI 600QS를 이용하여 현장에서 측정하였으며, 용존산소(DO)는 현장에서 DO meter를 사용하여 측정하는 방법과 산소병에 고정하여 실험실로 옮긴 후 Winkler-Azide 방법을 병행하여 측정하였다[12].
성능/효과
- 이는 연안해역 해수가 용출되는 용천수로 유입되면서 추가적으로 세균학적 오염이 원인이라고 사료된다. 따라서 인근해역내 해수는 수산물 품질관리법의 지정해역기준과 미국의 허가해역 수질기준에서 제시하고 있는 지정해역의 세균학적 기준인 분변계대장균 수의 기하평균치 14 MPN/100 ml 이하의 관리규정에 부합할 수 있는 요인이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 8->1,600 MPN/100 ml의 수치를 나타나는 것으로 조사되었다. 분변계대장균수의 범위를 정점별 평균값을 살펴보면 용천수 정점 1번, 2번, 10번, 11번을 제외한 모든 정점에서 기하평균치가 14 MPN/100 ml 이상의 평균값을 나타냈으며, 그 중 3번, 16번 정점에서 기하평균치값 100 MPN/100 ml 이상의 높은값을 나타내었다. 이는 연안해역 해수가 용출되는 용천수로 유입되면서 추가적으로 세균학적 오염이 원인이라고 사료된다.
- 전체적으로 총대장균군 범위는 1,600 MPN/100 ml로 조사되었으며, 분변계대장균 또한 1,600 MPN/100 ml의 수치를 나타나는 것으로 조사되었다.
- 조사결과 6.06±1.86 mg/l로 대부분의 지점에서 평균 6∼7 mg/l의 용존 산소량을 보였다.
후속연구
- 따라서 농수산업 경제활동에 의해 비점원적 오염원이 될 수 있는 주된 부분은 경작활동과 마을 공동목장의 운영을 들 수 있으며, 이러한 병원성 미생물들은 수온의 상승과, 장마 등에 의한 외부 환경에 의해 더욱 나타날 것으로 사료된다. 앞으로 이와 관련하여 장기적인 모니터링을 통한 용천수에 존재하는 유해한 병원성 미생물의 서식 파악 및 관리는 피서철 용천수를 이용하여 담수욕장 및 물맞이 장소로써의 이용과 수질이 양호한 용천수를 이용한 명수로써의 관광자원 개발활용에 매우 중요할 것으로 사료된다.
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