N-Methylacetamide 동결보호제가 오계 동결정액의 생존성, 수정 및 부화율에 미치는 영향 Effects of N-Methylacetamide on the Viability, Fertility and Hatchability of Cryopreserved Ogye (Korean Native Black Fowl) Semen원문보기
본 연구는 동결보호제로 이용되는 MA가 오계 정액의 생존율과 생산된 종란의 수정 및 부화율에 미치는 영향을 검토하여 재래가금의 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 실시하였다. 10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다. 7일 동안 생산된 종란을 각각 114개 및 115개를 회수하여 인공부화기에 입란하였고, 발생 7일째에 검란하여 수정율을 관찰하였으며, 발생 21일째에 부화율과 발육 중지란을 조사하였다. 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 66.36%로 관찰되었으며, MA가 함유된 희석액으로 준비한 동일한 농도의 신선 정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 94.98%로 관찰되었다. 또한, MA 동결보호제가 함유된 희석정액과 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 부화율은 모두 90% 이상으로 관찰되어 유의성이 없었으며, Glycerol 동결보호제의 문제점으로 보고된 수정 능력 및 부화 억제 효과는 없는 것으로 사료된다. 그러므로 동결정액을 이용한 종란에서 무정란 수는 신선한 희석 정액을 사용하였을 때보다 약 6.3배로 유의적 높았으나, 동결보호제에 의한 효과로 추정되지는 않았다. 닭 동결정액의 기술의 실용화를 위해서는 조류 정액의 보존 및 동결 연구에는 여전히 해결되어야 할 문제점이 많으며, 특히 품종 간 및 개체 간의 변이가 크기 때문에 앞으로 더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.
본 연구는 동결보호제로 이용되는 MA가 오계 정액의 생존율과 생산된 종란의 수정 및 부화율에 미치는 영향을 검토하여 재래가금의 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 실시하였다. 10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다. 7일 동안 생산된 종란을 각각 114개 및 115개를 회수하여 인공부화기에 입란하였고, 발생 7일째에 검란하여 수정율을 관찰하였으며, 발생 21일째에 부화율과 발육 중지란을 조사하였다. 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 66.36%로 관찰되었으며, MA가 함유된 희석액으로 준비한 동일한 농도의 신선 정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 94.98%로 관찰되었다. 또한, MA 동결보호제가 함유된 희석정액과 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 부화율은 모두 90% 이상으로 관찰되어 유의성이 없었으며, Glycerol 동결보호제의 문제점으로 보고된 수정 능력 및 부화 억제 효과는 없는 것으로 사료된다. 그러므로 동결정액을 이용한 종란에서 무정란 수는 신선한 희석 정액을 사용하였을 때보다 약 6.3배로 유의적 높았으나, 동결보호제에 의한 효과로 추정되지는 않았다. 닭 동결정액의 기술의 실용화를 위해서는 조류 정액의 보존 및 동결 연구에는 여전히 해결되어야 할 문제점이 많으며, 특히 품종 간 및 개체 간의 변이가 크기 때문에 앞으로 더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.
The use of methylacetamide (MA) as a cryoprotective agent for freezing Korean Native Black rooster Ogye semen was examined with artificial insemination. The diluted Ogye semen with HS-1 was subjected for 2 step dilution method of cryopreservation in which the final concentration of MA was adjusted t...
The use of methylacetamide (MA) as a cryoprotective agent for freezing Korean Native Black rooster Ogye semen was examined with artificial insemination. The diluted Ogye semen with HS-1 was subjected for 2 step dilution method of cryopreservation in which the final concentration of MA was adjusted to 7.5%. The sperm viability after thawing was reduced from $95.17{\pm}0.93%$ to $55.93{\pm}1.38%$ which was confirmed by live-death analysis based on Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). The rates of fertilized eggs with fresh or frozen-thawed semen were reduced from $94.98{\pm}3.93%$ to $66.36{\pm}8.43%$ at day 7 with significant difference. However, the hatching rates of experiments at day 21 did not shown difference between $92.64{\pm}2.33%$ and $90.45{\pm}8.05%$ (P<0.05). With these results, the utilization of MA for freezing of Ogye spermatozoa could affect on viability of frozen-thawed semen but not on the fertility of lain eggs and hatchability of fertilized eggs and also provide possible tools of freezing for poultry genetic resource conservation.
The use of methylacetamide (MA) as a cryoprotective agent for freezing Korean Native Black rooster Ogye semen was examined with artificial insemination. The diluted Ogye semen with HS-1 was subjected for 2 step dilution method of cryopreservation in which the final concentration of MA was adjusted to 7.5%. The sperm viability after thawing was reduced from $95.17{\pm}0.93%$ to $55.93{\pm}1.38%$ which was confirmed by live-death analysis based on Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). The rates of fertilized eggs with fresh or frozen-thawed semen were reduced from $94.98{\pm}3.93%$ to $66.36{\pm}8.43%$ at day 7 with significant difference. However, the hatching rates of experiments at day 21 did not shown difference between $92.64{\pm}2.33%$ and $90.45{\pm}8.05%$ (P<0.05). With these results, the utilization of MA for freezing of Ogye spermatozoa could affect on viability of frozen-thawed semen but not on the fertility of lain eggs and hatchability of fertilized eggs and also provide possible tools of freezing for poultry genetic resource conservation.
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문제 정의
본 연구는 동결보호제로 사용되는 MA를 이용하여 재래가금인 오계정액의 생존성, 수정율 및 부화율에 미치는 영향을 검토하였으며, 재래 닭 품종의 정자 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 하였다.
본 연구는 동결보호제로 이용되는 MA가 오계 정액의 생존율과 생산된 종란의 수정 및 부화율에 미치는 영향을 검토하여 재래가금의 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 실시하였다. 10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다.
제안 방법
본 연구는 동결보호제로 이용되는 MA가 오계 정액의 생존율과 생산된 종란의 수정 및 부화율에 미치는 영향을 검토하여 재래가금의 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 실시하였다. 10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다. 7일 동안 생산된 종란을 각각 114개 및 115개를 회수하여 인공부화기에 입란하였고, 발생 7일째에 검란하여 수정율을 관찰하였으며, 발생 21일째에 부화율과 발육 중지란을 조사하였다.
10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다. 7일 동안 생산된 종란을 각각 114개 및 115개를 회수하여 인공부화기에 입란하였고, 발생 7일째에 검란하여 수정율을 관찰하였으며, 발생 21일째에 부화율과 발육 중지란을 조사하였다. 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 66.
Fig. 1에서는 3.64×109/ mL 농도의 원정액과 910×106 /mL 농도의 동결 및 융해된 동결정자를 이용하여 총 10,000개의 정자에서 SYBR-14와 PI의 형광 발현 분포도를 2차원 dot plots으로 표현하였다.
PI+SYBR- 집단은 막 투과성이 파괴된 정자군으로 생존능력이 없는 정자군으로 간주되었으며, PI+SYBR+ 집단은 PI와 SYBR의 염색이 동시에 이루어지는 집단으로 FACS의 분석 과정에서 죽어가는 정자군으로 간주하였다.
공시된 오계의 정자를 동결 보존하는데 있어서 동결보호제로 MA가 정자의 융해 후 생존성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 정자의 생사염색을 실시하였다. Fig.
동결보호제로서 MA가 수정율과 부화율에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 대조군으로서 MA가 첨가된 희석액으로 1:4의 비율로 희석된 정액과 실험군으로써 동일하게 희석된 정액을 동결 및 융해하여 암컷 White Leghorn에 인공수정을 실시하였다. Table 3에서는 7일 동안 회수된 수정란의 수, 수정율, 발생중지란의 수 및 부화율에 관한 결과를 표시하였다.
채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 10분 이내로 실험실로 운반하였다. 운반된 정액은 5℃하에서 동결보호제가 첨가되지 않은 HS-1 희석액으로 1:1 비율로 희석 후 30분간 평형시간을 가진 후, 1차 희석정액에 동일 비율로 15% MA를 첨가한 희석액에 1:1 비율로 희석하여 동결보호제 MA의 최종 농도를 7.5%로 맞추었다. 본 연구에 이용된 닭 정액 희석액인 HS-1의 조성은 Table 1에 표현하였으며, 포장용기로는 0.
2 mL 정액을 1 mL 주사기를 이용하여 암탉의 질 속 2～3cm에 주입되도록 하였다. 인공수정은 오후에 이틀 연속으로 실시 후 3일 후에 2차 수정을 실시하였다. 집란은 첫 수정 후 48시간째부터 7일간 종란을 수집하였다.
수집된 종란은 훈증 소독을 거쳐 종란 보관실에 저장하였다. 입란 후 7일째 검란등을 이용하여 수정율을 조사하였으며, 21일째 부화율을 조사하였다.
인공수정은 오후에 이틀 연속으로 실시 후 3일 후에 2차 수정을 실시하였다. 집란은 첫 수정 후 48시간째부터 7일간 종란을 수집하였다. 수집된 종란은 훈증 소독을 거쳐 종란 보관실에 저장하였다.
희석 정액과 5℃ 조정된 저온 수조에서 2분간 융해시킨 동결정액의 생존율은 SYBR-14와 Propidium iodide(PI)(Live/Dead sperm viability Kit, Invitrogen, USA)의 이중 형광 프로브를 이용하여 HS-1 희석액에 최종 농도 90×106/mL로 희석된 희석된 400 μL 정액에 DMSO를 이용하여 20 μM 농도로 희석된 SYBR-14 5 μL를 첨가하여 실온에서 5분간 배양하고 2.4 mM 농도의 PI 5 μL를 다시 첨가하여 5분간 배양한 후에 유세포분석기(BD FACS Aria, USA)를 이용하여 생존율을 분석하였다(Christensen, 2004; Donoghue, 1996; Garner, 1995).
희석정액과 동결정액의 생존율 및 인공수정을 실시하여 수집된 종란에서 각각 무정란, 발생중지란 및 부화란 수를 조사하였다.
대상 데이터
국립축산과학원 가축유전자원 시험장에서 보존 중인 오계(62주령) 수탉 10수를 정액 채취용으로 사용하였으며, 인공수정용 암탉은 동일 주령의 White Leghorn 40수를 공시하였다.
5%로 맞추었다. 본 연구에 이용된 닭 정액 희석액인 HS-1의 조성은 Table 1에 표현하였으며, 포장용기로는 0.5 mL straws(FHK, Japan)를 사용하였고, 동결 방법으로 액체질소상면 4 cm에서 30분간 동결 후 -196℃에 침지하였다(Hanza- wa, 2010).
데이터처리
6. 통계처리
통계분석은 Statistical Analysis System(SAS release ver. 9.1, 2002)의 General Linear Model procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고 One-way ANOVA procedure를 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
정액 채취는 마사지 정액채취법(Burrows and Quinn, 1935, 1937)의 변형인 횡취법(side collection)으로 주 2회 눈금이 있는 15 mL 튜브(Becton Dickinson, USA)에 혼합 채취하였다. 채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 10분 이내로 실험실로 운반하였다.
성능/효과
Table 3에서는 7일 동안 회수된 수정란의 수, 수정율, 발생중지란의 수 및 부화율에 관한 결과를 표시하였다. 7% MA가 첨가된 동결희석액을 이용한 동결정액의 수정율과 부화율은 각각 66.36%와 90.45%로 관찰되었으며, 동일한 농도의 MA가 함유된 HS-1희석액으로 희석된 신선정액의 수정율과 부화율은 94.98%와 92.64%로 각각 관찰되었다. 이와 같은 결과는 동결보호제로서 MA는 오계 동결정자의 수정란에 대한 수정율에는 유의적 수준으로 차이가 났으나 부화율에 유의적 차이가 없는 것으로 관찰되었으며 동결 후 융해된 정자를 이용하여 생산된 종란의 수정율 저하 현상은 동결 과정에서 손상을 받은 정자의 효과로 추정되며, 그 외에 알려지지 않은 다른 요인에 의하여 발생한 원인으로 사료된다(P<0.
7일 동안 생산된 종란을 각각 114개 및 115개를 회수하여 인공부화기에 입란하였고, 발생 7일째에 검란하여 수정율을 관찰하였으며, 발생 21일째에 부화율과 발육 중지란을 조사하였다. 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 66.36%로 관찰되었으며, MA가 함유된 희석액으로 준비한 동일한 농도의 신선 정액을 이용하여 생산된 종란의 수정율은 94.98%로 관찰되었다. 또한, MA 동결보호제가 함유된 희석정액과 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 부화율은 모두 90% 이상으로 관찰되어 유의성이 없었으며, Glycerol 동결보호제의 문제점으로 보고된 수정 능력 및 부화 억제 효과는 없는 것으로 사료된다.
98%로 관찰되었다. 또한, MA 동결보호제가 함유된 희석정액과 동결정액을 이용하여 생산된 종란의 부화율은 모두 90% 이상으로 관찰되어 유의성이 없었으며, Glycerol 동결보호제의 문제점으로 보고된 수정 능력 및 부화 억제 효과는 없는 것으로 사료된다. 그러므로 동결정액을 이용한 종란에서 무정란 수는 신선한 희석 정액을 사용하였을 때보다 약 6.
신선정액의 살아있는 정자군는 95.2%고, 동결정액의 살아있는 정자군은 55.9%로 유의적으로 감소하였으며, 희석된 신선정액의 경우, 죽은 정자군은 3.6%로 관찰되어 동결정액의 39.43%와 차이가 나타났으며, 죽어가는 정자군은 각각 0.4%와 3.7%로 각각 유의적 수준의 차이가 관찰되었다(P<0.05).
후속연구
본 연구에서는 오계의 정자를 이용하여 백색산란계인 White Leghorn에 수정하여 동결정자의 수정율과 부화율을 판단하였으며, 이와 같은 이유로 계통간의 차이가 오계만을 이용하여 실험을 반복할 때에 도출되는 결과와는 차이가 있을 것으로 추정된다. 그러므로, 닭 정액의 유전자원 보존연구에 있어서 계통간의 변이를 최소화하는 동결보존방법에 대하여 추후 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다.
3배로 유의적 높았으나, 동결보호제에 의한 효과로 추정되지는 않았다. 닭 동결정액의 기술의 실용화를 위해서는 조류 정액의 보존 및 동결 연구에는 여전히 해결되어야 할 문제점이 많으며, 특히 품종 간 및 개체 간의 변이가 크기 때문에 앞으로 더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
MA는 어떤 목적으로 이용되는가?
본 연구는 동결보호제로 이용되는 MA가 오계 정액의 생존율과 생산된 종란의 수정 및 부화율에 미치는 영향을 검토하여 재래가금의 동결보존 방법의 기초를 마련하고자 실시하였다. 10수의 오계 수탉에서 채취한 혼합정액을 희석정액을 제조하고 동시에 동일한 희석액으로 준비된 신선정액을 준비하여 각각 20수의 White Leghorn 암탉에 인공수정하였다.
국내에서 산업적으로 실용화되어 사용하는 생식세포 동결보존은 무엇인가?
가축 유전자원을 성공적으로 보존하는 기술로서 생식세포 동결보존은 생체보존을 대체할 수 있으며, 동물유전자원을 보다 경제적으로 보존할 뿐만 아니라 증식효율을 조절할 수 있어 유전집단의 관리에도 효과적으로 활용되고 있다. 현재 국내에서는 소의 정액 동결보존기술만이 산업적으로 실용화되어 널리 이용되고 있으나, 가금 정액의 동결보존기술에 대한 연구는 미진하여 실험실 수준에 머무르고 있다. 특히 오계의 경우, 유전자원으로 보존할 가치가 높으나, 생축으로만 보존 및 유지되고 있어 악성 질병에 취약할 가능성이 높다고 추정된다.
횡취법은 어떤 실험법의 변형인가?
정액 채취는 마사지 정액채취법(Burrows and Quinn, 1935, 1937)의 변형인 횡취법(side collection)으로 주 2회 눈금이 있는 15 mL 튜브(Becton Dickinson, USA)에 혼합 채취하였다. 채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 10분 이내로 실험실로 운반하였다.
참고문헌 (24)
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