[논문]Coomassie brilliant blue G 및 R을 이용한 말 정액 첨체 염색 기법

김성우; 신상민; 유연희; 이재영; 김찬란; 고응규

doi:10.5762/kais.2020.21.9.57

Coomassie brilliant blue G 및 R을 이용한 말 정액 첨체 염색 기법
Acrosome staining with Coomassie brilliant blue G or R on the horse spermatozoa 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.21 no.9, 2020년, pp.57 - 63

김성우 (국립축산과학원 가축유전자원센터) , 신상민 (국립축산과학원 난지축산연구소) , 유연희 (국립축산과학원 가축유전자원센터) , 이재영 (국립축산과학원 가축유전자원센터) , 김찬란 (국립축산과학원 가축유전자원센터) , 고응규 (국립축산과학원 가축유전자원센터)

초록
AI-Helper

말 정자의 첨체 손상도를 간단하게 분석하는 기술을 개발하기 위하여 Coomassie brilliant blue G 또는 R 염색 시약을 이용하여 정자 도말 슬라이드에 대한 염색도를 조사하였고, 3.7% paraformaldehyde (PF)과 35% methanol (MT) 고정제가 첨체 염색에 미치는 영향을 연구하였다. PF로 고정한 후 말 정자 도말 슬라이드를 0.05, 0.1 및 0.2 % 농도 CBB에 각 2분간 염색을 실시하여 첨체를 관찰하면 0.05%의 경우 완전한 첨체 염색도가 G형에서 62.6%, R형은 61.5%로 관찰되었으나, 0.1 및 0.2%의 경우, 80.2 및 79.7%로 (G 형), 78.1 및 76.0%로 (R 형) 관찰되어 유의적 차이가 나타났다. 그러나 MT 고정제를 이용할 경우, 첨체 외막이 느슨해진 정자의 비율은 3.5%로 관찰되어 PF 고정제를 사용하면 9.0%로 관찰되어 유의적으로 낮게 관찰되었다. 이러한 결과는 말정자첨체손상도를 관찰하기 위하여 CBB G 또는 R형 염색시약을 0.1~0.2% 농도로 이용될 수 있음을 증명한다. 또한, 말 정자 슬라이드 도말을 고정하는데 있어 고정제의 선택이 중요하며 MT보다 PF를 활용하는 것이 첨체 변화 과정 중인 정자를 관찰하는데 중요하다는 보여 준다. 이러한 방법은 말의 인공수정을 위한 정액의 저온저장 또는 동결보존과정 중에서 정자첨체손상율을 정확하게 판별하는데 이용될 수 있음을 증명한다.

Abstract ▼ AI-Helper

To develop simple acrosome staining of horse spermatozoa, this study tested the binding properties of Coomassie brilliant blue G or R on the sperm smears after 3.7% paraformaldehyde (PF) or 35% methanol (MT) fixation. After being fixed with PF and stained with 0.05, 0.1, or 0.2 % of CBB G or R for 2 min, horse spermatozoa were examined for their intact acrosome status. The intact acrosome of fresh horse spermatozoa were 62.6% and 61.5% with 0.05% of the G and R CBB solution, but 80.2 and 79.7% with G type and 78.1 and 76.0% with R type. On the other hand, when MT was used for fixation, the acrosome reacting sperm ratio was 3.5%, but was 9.0% in the case of PF. These results show that the intact acrosome of horse sperm could be judged using a 0.1~0.2% CBB G or R staining technique. PF would be an essential fixative for examining acrosome reacting horse spermatozoa. This method could be used to identify sperm with a damaged acrosome during low-temperature storage or cryopreservation for artificial insemination of horses.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. The image of methanol stock of CBB-R (a) and CBB-G (b)
그림 Fig. 2. The image of horse spermatozoa stained with 0.2 Coomassie blue stain R. Spermatozoa with intact acrosome (a) have bright blue staining pattern over the entire acrosome, but damaged spermatozoa with swollen outer membrane (b) or with no staining pattern overthe acrosome (c). The white bar is 10 ㎛
그림 Fig. 3. The effects of CBB-G concentration on acrosome status of fresh horse spermatozoa. Data are expressed as the mean±SD for three independent experiments. Different superscripts mean statistically different values (p<0.05).
그림 Fig. 4. The effects of CBB-R concentration on acrosome status of fresh horse spermatozoa. Data are expressed as the mean±SD for three independent experiments. Different superscript smean statistically different values (p<0.05).
그림 Fig. 5. The effects of fixative on acrosome status of fresh horse spermatozoa. MT = 35% methanol fixative, PF = 3.7% paraformaldehyde fixative. Data are expressed as the mean±SD for five independent experiments. Different superscripts mean statistically different values (p<0.05).
표 Table 1. The Acrosome status of frozen horse semen stained by CBB-R and its motility

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구는 말 정자 첨체 염색을 간편하게 실시하는 방법에 관한 연구로 CBB시약에 대한 자료를 확보하였다. 도말 슬라이드는 현장에서 간단하게 준비할 수 있고 추후 염색을 통하여 분석하는 방법이므로 가장 간단하다고 판단되었다.
본 연구에서는 말 정자 첨체의 신속한 판단을 위하여 조직염색기법으로서 CBB염색기법을 개선하기 위하여 실험을 수행하였으며 한라마 정자를 이용하여 첨체염색에 대한 자료를 확보하기 위하여 연구를 수행하였다.

제안 방법

희석된 신선 정액을 calcium과 magnesium이 없는 PBS로 1:9의 부피비율로 혼합하여 650 g 에서 10 분간 원심 분리하여 희석액 성분을 제거하였으며 10~20 µl의 정자를 슬라이드위에 올리고 다른 슬라이드를 이용하여 천천히 도말을 실시하였다. 3.7% paraformaldehyde가 포함된 PBS (PF-PBS) 또는 35% methanol에 슬라이드를 1, 2 및 3분간 침지하여 고정을 실시하였다. 고정된 슬라이드는 PBS에 2회, 10초간 연이어 침지하여 잔여 PF-PBS를 제거하고 CBB 염색 시약에 각각 2분간 침지하여 염색하였다.
7% paraformaldehyde가 포함된 PBS (PF-PBS) 또는 35% methanol에 슬라이드를 1, 2 및 3분간 침지하여 고정을 실시하였다. 고정된 슬라이드는 PBS에 2회, 10초간 연이어 침지하여 잔여 PF-PBS를 제거하고 CBB 염색 시약에 각각 2분간 침지하여 염색하였다. 염색 후 공기 중에서 도말된 슬라이드를 건조시켜 정자 염색슬라이드를 준비하였다.
염색 후 공기 중에서 도말된 슬라이드를 건조시켜 정자 염색슬라이드를 준비하였다. 동결정액은 37℃에서 45 초간 융해하여 사용하였으며, 염색이 끝난 도말 슬라이드는 모두 증류수에 1 회 5 초간 침치하여 여백에 존재하는 여분의 염색시약을 제거하고 37℃ 슬라이드 가온판 위에서 2-3 분 동안 건조시키고 현미경으로 관찰하였다.
염색슬라이드는 100 배 오일 렌즈가 장착된 현미경 (IX71, Olympus, Japan)으로 관찰하였으며, 그림 2에서 관찰되는 바와 같이 첨체가 온전한 정자, 첨체 반응으로 첨체의 외막이 늘어진 형태를 보이는 첨체 반응된 정자 및 첨체 반응이 일어난 정자로 판단하였으며 최소 200 개 이상의 정자를 판정하여 정액의 첨체 변화도를 판정하였다.
희석된 신선 정액을 calcium과 magnesium이 없는 PBS로 1:9의 부피비율로 혼합하여 650 g 에서 10 분간 원심 분리하여 희석액 성분을 제거하였으며 10~20 µl의 정자를 슬라이드위에 올리고 다른 슬라이드를 이용하여 천천히 도말을 실시하였다.

대상 데이터

한라마(제주마와 더브렛의 교배종) 3두의 정액을 인공질법으로 발정기의 암컷을 이용하여 정액을 채정하였다. 필터컵으로 점액질을 제거된 정액을 INRA 96희석액으로 1:2에서 1:3의 부피로 희석하여 650 g에서 15 분간 원심분리를 실시하여 정장액을 제거하였다.

데이터처리

융해된 세포의 생존율을 One-way ANOVA test를 실시하여 분석하였으며 분석된 자료의 평균간 유의성은 Duncan의 다중검증법(Duncan’s multiple range test)로 분석을 실시하였다.

성능/효과

0.05% 농도에서는 61.5±2.8%로 관찰되었고 0.1% 및 0.2% 농도에서는 78.1±1.9% 및 76.0±4.8%로 관찰되었고 유의적 차이가 존재하였다.
Fig 3은 CBB-G로 신선 정액을 염색한 결과로, 0.05% 농도에서는 완전한 첨체의 염색도가 62.6±6.6%로 관찰되었고 0.1% 및 0.2% 농도에서는 80.2±5.8% 및 79.7±3.9%로 관찰되었고 유의적 차이가 존재하였다.
Fig 5에서 보는 바와 같이, 한라마의 신선정액을 도말 슬라이드로 제작하고 35% methanol 또는 3.7%의 PF 로 각각 2분간 고정한 후 2% CBB-R로 2분간 염색하였을때, 첨체 손상이 없는 정자의 비율은 각각 79.1±4.5%와 82.0±3.8%로 관찰되어 유의적 차이가 없었다.
2% 모두 말 정자 첨체염색에 이용할 수 있는 것으로 판단되었다. 그러나 CBB-G의 경우, 상온에서 1일 보존된 염색시약에서 응고된 형태의 염색도가 CBB-R보다 많이 나타났으며 이는 슬라이드 도말에서 비 특이적 염색도가 증가하는 현상이 관찰되었다. CBB의 이러한 특성은 연구자에 따라 염색시약의 선호도를 결정할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구는 말 정자 첨체 염색을 간편하게 실시하는 방법에 관한 연구로 CBB시약에 대한 자료를 확보하였다. 도말 슬라이드는 현장에서 간단하게 준비할 수 있고 추후 염색을 통하여 분석하는 방법이므로 가장 간단하다고 판단되었다. 도말 정자의 염색도를 관찰하면 말 정자는 3.
도말 슬라이드는 현장에서 간단하게 준비할 수 있고 추후 염색을 통하여 분석하는 방법이므로 가장 간단하다고 판단되었다. 도말 정자의 염색도를 관찰하면 말 정자는 3.7% PF와 0.2% CBB-R 또는 CBB-G를 이용하여 2분간 염색하는 것이 말 첨체 분석에 유리한 것으로 판단되었다. 특히 말 정자는 동결보존에 취약한 특성을 나타나는 축종으로 정자의 손상도 분석은 다른 축종보다 더 중요하다고 알려져 있다[8, 21].
본 연구에서는 CBB-G와 CBB-R의 염색시약 모두 말정액에 응용될 수 있음을 밝혔으며 신선정액과 동결 정액 모두 도말슬라이드를 이용하여 분석할 수 있었다. 신선하게 제조된 시약일수록 깨끗한 염색성을 관찰할 수 있었으며, 0.
본 연구에서는 CBB-G와 CBB-R의 염색시약 모두 말정액에 응용될 수 있음을 밝혔으며 신선정액과 동결 정액 모두 도말슬라이드를 이용하여 분석할 수 있었다. 신선하게 제조된 시약일수록 깨끗한 염색성을 관찰할 수 있었으며, 0.05% 농도에서는 첨체 염색도가 충분하지 않아 False Negative로 볼 수 있는 염색이 증가하였다. 즉 첨체반응이 완료된 것과 유사한 형태의 정자로 정상정자가 판정될 수 있음을 보여주고 있다.
첨체 반응이 완전히 일어나 첨체가 염색되지 않는 비율 또한 36.6±6.6%, 9.7±2.6 및 10.5±2.8%로 관찰되었고 0.05%는 유의적으로 높게 관찰되었다.
첨체반응이완전히 일어나 첨체가 염색되지 않는 비율 또한 37.0±3.0%, 12.5±3.7 및 13.6±2.4%로 관찰되었고 0.05%는 유의적으로 높게 관찰되었다(Fig 4).
표 1에서 보는 바와 같이 한라마 3두의 동결 정액 도말을 이용하고 CBB-R 0.2% 용액으로 염색하였을 때, 온전한 첨체를 가진 정자의 비율은 개체마다 서로 달랐으며 운동성이 65.4±3.8%을 나타내는 정자에서는 온전한첨체를 가진 정자비율은 57.1±5.7%였고, 67.2±3.0%의 운동성을 보여주는 동결 정액의 경우 61.0±3.2%로, 47.9±7.5%는 5.6±6.8%로 관찰되어 운동성을 가진 정자의 비율이 첨체손상이 없는 정자의 비율보다 높게 나타내었다.

후속연구

가장 간단한 염색기법으로 CBB염색기법이 포유류의 정자 판단에 많이 이용되었으나[11] 염색시약의 특성에 따른 자료와 염색농도에 관한 자료는 찾아보기 어렵다. 그러므로 CBB에 의한 말 정자첨체의 염색성에 대한 세부 연구 자료를 확보함으로서 동결과정에서 첨체 변화도 분석을 용이하게 할 수 있어 인공수정과 종축으로서 활용성을 검증하기 위한 기본 자료로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
특히 말의 경우, 번식능력보다 승용마나 경주마로서의 능력이 더 중요하게 간주되고 있으며[21], 이런 가축 사육의 특성은 정자의 질적 저하가 다른 축종에 비하여 더 심한 경우가 많다[20-22]. 그러므로 말 정자 첨체손상도 분석은 중요한 의미를 가지며 본 연구에서 제안된 방법에 따르면, 특별한 장비 없이 현미경으로 보다 정확한 자료를 쉽고 빠르게 획득할 수 있어 말 산업에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	정자의 첨체의 특징은 무엇인가?	말 정액의 품질을 판정하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있으나 가장 흔히 사용하는 방법은 첨체의 완전성에 의한 판정 기법으로 알려져 있다[1-4]. 정자의 첨체는 수정과정에서 난관세포와 점막을 제거하는 효소를 함유하고 있으며 난자와 결합 시 투명대를 녹여 난자의 세포막과 정자두부의 막이 융합하여 새로운 생명체를 만드는 중요한 기능을 담당하고 있다[4, 5].
	말 정액의 품질을 판정하는 방법은 무엇이 있는가?	말 정액의 품질을 판정하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있으나 가장 흔히 사용하는 방법은 첨체의 완전성에 의한 판정 기법으로 알려져 있다[1-4]. 정자의 첨체는 수정과정에서 난관세포와 점막을 제거하는 효소를 함유하고 있으며 난자와 결합 시 투명대를 녹여 난자의 세포막과 정자두부의 막이 융합하여 새로운 생명체를 만드는 중요한 기능을 담당하고 있다[4, 5].
	말 정자의 첨체 손상도를 간단하게 분석하는 기술을 개발하기 위하여 고정제가 첨체 염색에 미치는 영향을 분석한 결과는 어떠한가?	7% paraformaldehyde (PF)과 35% methanol (MT) 고정제가 첨체 염색에 미치는 영향을 연구하였다. PF로 고정한 후 말 정자 도말 슬라이드를 0.05, 0.1 및 0.2 % 농도 CBB에 각 2분간 염색을 실시하여 첨체를 관찰하면 0.05%의 경우 완전한 첨체 염색도가 G형에서 62.6%, R형은 61.5%로 관찰되었으나, 0.1 및 0.2%의 경우, 80.2 및 79.7%로 (G 형), 78.1 및 76.0%로 (R 형) 관찰되어 유의적 차이가 나타났다. 그러나 MT 고정제를 이용할 경우, 첨체 외막이 느슨해진 정자의 비율은 3.5%로 관찰되어 PF 고정제를 사용하면 9.0%로 관찰되어 유의적으로 낮게 관찰되었다. 이러한 결과는 말정자첨체손상도를 관찰하기 위하여 CBB G 또는 R형 염색시약을 0.1~0.2% 농도로 이용될 수 있음을 증명한다. 또한, 말 정자 슬라이드 도말을 고정하는데 있어 고정제의 선택이 중요하며 MT보다 PF를 활용하는 것이 첨체 변화 과정 중인 정자를 관찰하는데 중요하다는 보여 준다. 이러한 방법은 말의 인공수정을 위한 정액의 저온저장 또는 동결보존과정 중에서 정자첨체손상율을 정확하게 판별하는데 이용될 수 있음을 증명한다.

참고문헌 (22)

J. I. Marti, J. A. Cebrian-Perez, T. Muino-Blanco, “Assessment of the acrosomal status of ram spermatozoa by RCA lectin-binding and partition in an aqueous two-phase system,” Journal of Andrology, Vol. 21, No. 4, pp. 541-548, January 2013. DOI: https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.2000.tb02119.x
V. G. Pursel, L. A. Johnson, G. B. Rampacek, “Acrosome morphologyof boar spermatozoa incubated before cold shock,” Journal of Animal Science, Vol. 34, No. 2, pp. 278-283, Febuary 1972. DOI: https://doi.org/10.2527/jas1972.342278x

상세보기
N. L. Cross, S. K. Watson, "Assessing acrosomal status of bovine sperm using fluoresceinated lectins," Theriogenology, Vol. 42, No 1 pp. 89-99, 1994. DOI: https://doi.org/10.1016/0093-691X(94)90665-6

상세보기
P. J. Casey, R. B. Hillman, K. R. Robertson, A. I. Yudin, I. K. M. Liu, E. Z. Drobnis, “Validation of an Acrosomal Stain for Equine Sperm That Differentiates Between Living and Dead Sperm,” Journal of Andrology, Vol. 14, No. 4, pp. 289-297, July/August 1993. DOI: https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.1993.tb03367.x

상세보기
J. M. Bedford, "Sperm capacitation and fertilization in mammals," Biology of Reproduction, Vol. 2, Supplement, pp. 128-158, 1970. DOI: https://doi.org/10.1095/biolreprod2.Supplement_2.128

상세보기
N. L. Cross, P. Morales, J.W. Overstreet, F.W. Hanson, “Two simple methods for detecting acrosomereacted human sperm,” Gamete Research, Vol. 15, No. 3, pp. 213-226, May 1986. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.1120150303

상세보기
A. M. Brum, A. D. Thomas, K Sabeur, B. A. Bal, "Evaluation of Coomassie blue staining of the acrosome of equine and canine spermatozoa", American Journal of Veterinary Research, Vol. 67, No. 2, pp. 358-362, May 2006. DOI: https://doi.org/10.2460/ajvr.67.2.358

상세보기
G. Kutvolgyi, J. Stefler, A. Kovacs, "Viability and acrosome staining of stallion spermatozoa by Chicago sky blue and Giemsa,", Biotechnic and Histochemistry, Vol. 81, No. 4-6, pp. 109-117, December 2006. DOI: https://doi.org/10.1080/10520290600931007

상세보기
A. L. Way, M. A Henault, G. J. Killian, "Comparison of four methods for evaluating acrosome status and viability of ejaculated and cauda epididymal bull spermatozoa,", Theirogenology, Vol. 43, No. 9, pp. 1301-1316, June 1995. DOI: https://doi.org/10.1016/0093-691X(95)00115-O

상세보기
P. F. Silva, B. M. Gadella, "Detection of damage in mammalian sperm cells,", Theriogenology, Vol. 65, No. 5, pp. 958-978, March 2006. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2005.09.010

상세보기
J. L. Larson, D. J. Miller, "Simple histochemical stain for acrosomes on sperm from several species,", Molecular Reproduction and Development, Vol. 52, No. 4, pp. 445-449, April 1999. DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2795(199904)52:4 3.0.CO;2-6

상세보기
J. L. Brunelle, R. Green, "Coomassie Blue Staining,", Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part C, pp. 161-167, March 2014. DOI: https://doi.org/10.1016/b978-0-12-420119-4.00013-6
B. M. Gadella, R. Rathi, J.F.H. M. Brouwers, T.A.E. Stout, B. Colenbrander, "Capacitation and the acrosome reaction in equine sperm,", Animal Reproduction Science, Vol. 68, No. 3-4 pp. 249-265, December 2001. DOI: https://doi.org/10.1016/s0378-4320(01)00161-0

상세보기
R. Kahn, R. W. Rubin, "Quantitation of submicrogram amounts of protein using Coomassie brilliant blue R on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide slab-gels,", Analytical Biochemistry, Vol. 67, No. 1 pp. 347-352, July 1975. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90305-x

상세보기
I. Syrovy, Z. Hodny, "Staining and quantification of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis,", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol. 569, No. 1-2, pp. 175-196, September 1991. DOI: https://doi.org/10.1016/0378-4347(91)80229-6

상세보기
M. A. Alvarenga, F. O. Papa, C. R. Neto, "Advances in Stallion Semen Cryopreservation,", Veterinay Clinics of North Amererica: Equine Practice, Vol. 32, No. 3 pp. 521-530, October 2016. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cveq.2016.08.003

상세보기
E. S. Metcalf, "The efficient use of equine cryopreserved semen,", Theriogenology, Vol. 68, No. 3 pp. 423-428, August 2007. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2007.04.039

상세보기
S. Prien, S. Iacovides, "Cryoprotectants & cryopreservation of equine semen: a review of industry cryoprotectants and the effects of cryopreservation on equine semen membranes,", Journal of Dairy, Veterinay and Animal Research, Vol. 3, No. 1, pp. 1-7, January 2016. DOI: https://doi.org/10.15406/jdvar.2016.03.00063
J. Aurich, J. Kuhl, A. Tichy, C. Aurich, "Efficiency of Semen Cryopreservation in Stallions,", Animals, Vol. 10, No. 6, article 1033, June 2020. DOI: https://doi.org/10.3390/ani10061033

상세보기
C. Gautier, D. Scarlet, R. Ertl, I. Walter, M. Wulf, C. Nagel, J. Aurich, C. Aurich, "Expression of enzymes involved in polyunsaturated fatty acid synthesis in the stallion testes and epididymis,", Reproduction, Fertility and Devlopemnt, Vol. 32, pp. 851-861, June 2020. DOI: https://doi.org/10.1071/RD19342

상세보기
R. A. Griffin, M. Baker, R. J. Aitken, A. Swegen, Z. Gibb, "What makes a fertile sperm? Unique molecular attributes of stallion fertility,", Reproduction, Vol. 158, No. 4, pp. R125-R137, October 2019. DOI: https://doi.org/10.1530/REP-19-0060

상세보기
B. Leemans, T. A. E. Stout, C. De Schauwer, S. Heras, H. Nelis, M. Hoogewijs, A. Van Soom, B. M. Gadella, "Update on mammalian sperm capacitation: how much does the horse differ from other species?", Reproduction, Vol. 157, No. 5, pp. R181-R197, May 2019. DOI: https://doi.org/10.1530/REP-18-0541

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증