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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 한국산 꿩의다리속 안에서 cpDNA trnL-F 지역의 1) 염기서열의 유사성, 길이, GC contents 분석 등을 포함한 분자진화를 확인하고, 2) 모계유전을 통한 진화적 유연관계를 추론하고자 하였다. 또한, 3) 계통발생학적 형질로 indels의 영향과 유용성을 평가하고자 하였다.
- 따라서, 본 연구는 한국산 꿩의다리속 안에서 cpDNA trnL-F 지역의 1) 염기서열의 유사성, 길이, GC contents 분석 등을 포함한 분자진화를 확인하고, 2) 모계유전을 통한 진화적 유연관계를 추론하고자 하였다. 또한, 3) 계통발생학적 형질로 indels의 영향과 유용성을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- BI 분석은 기본값(gap =missing)의 자료와 gaps를 SeqState v1.4.1 (Müller, 2005)을 이용하여 MCIC (modified complex indel coding)방법으로 코딩한(Müller, 2006; Simmons et al., 2007) 후 유합하여 자료를 만들어 각각 분석하여 비교하였다.
- Indels 지역은 몇몇 절 수준에서 해상력을 제공하였으며 특히, Chars 4에 있는 정렬된 trnL intron 280−319 positions는 length-mutational events로 속 내 다른 절과 좀꿩의다리절 사이의 유연관계에 대해서 중요한 정보를 제공하였다.
- 4). Indels를 코딩하여 유합한 자료로 나타난 베이시안 계통수로부터 형질의 변화(Unambiguous changes only)를 추적하였다(Fig. 4). 한국산 꿩의다리속 안에서 추론된 indels evolution은 부분적인 분계조들의 공동파생형질이거나 몇몇 종의 단독파생형질로 나타났다(Fig.
- PCR 반응액은 SolgTM Gel & PCR purification system kit (SolGent Co., Daejeon, Korea)로 정제하였으며, 염기서열 분석은 automatic sequencer (ABI PRISM 3730xl)을 이용하였다.
- 정렬된 데이터는 Geneious pro를 사용하여 적절하지 않은 indels 부분을 수정하였다. tRNALeu(UAA) intron과 IGS 염기서열의 annotation은 DOGMA (Dual Organellar GenoMe Annotator) (Wyman et al., 2004)로부터 annotation된 Thalictrum coreanum 염기서열(trnT-trnL-trnF region; S. Park, unpubl. data)과 비교하여 gene, intron, spacer의 경계를 정의하였다. 분자진화의 중립성 검증(neutrality test)은 DnaSP v5.
- trnL-F 지역의 증폭을 위한 PCR 반응용액의 조성은 주형 DNA 20−50 ng, 10X DiaStarTM Taq buffer 5 μl, 10 mM의 dNTPs 1 μl, 10 pmol의 primers 각각 2 μl, 1.25 unit의 DiaStarTM Taq polymerase (SolGent Co., Daejeon, Korea), 및 증류수가 포함된 총 50 μl의 반응액을 95℃에서 3분 동안 initial denaturation한 후 denaturation 95℃에서 30초, annealing 54−58℃에서 40초, extension 72℃에서 1분으로 구성된 반응을 35−40회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 extension하여 수행하였다.
- 코딩된 자료의 모델은 morphological data (standard discrete model)처럼 Lewis (2001)에 기초하여 dataset에 적용하였다. 각각 Markov chain 5,000,000 generations를 반복하여, 매 500 generations마다 tree를 저장하였다. 그 후, Tracer v1.
- 각각 Markov chain 5,000,000 generations를 반복하여, 매 500 generations마다 tree를 저장하였다. 그 후, Tracer v1.5 (Rambaut and Drummond, 2009)을 사용하여 effective sample size (ESS)값을 기초로 convergence을 확인 후 초기 10% burn-in한 후 50% majority rule consensus tree와 posterior probabilities (PP)를 평가하였다. Indels character state distributions의 최적화는 MacClade v4.
- 모든 형질은 ‘equal weight’를 주었고, Consistency index (CI; Kluge and Farris, 1969), Retention index (RI; Farris, 1989)와 Rescaled consistency index (RC)을 산출하였다.
- 모든 형질은 ‘equal weight’를 주었고, Consistency index (CI; Kluge and Farris, 1969), Retention index (RI; Farris, 1989)와 Rescaled consistency index (RC)을 산출하였다. 분계도의 확실성을 평가하기 위한 bootstrap (Felsenstein, 1985)과 jackknife (Farris et al., 1996) 분석은 PAUP을 이용하여 산출하였다(1000 replicates with 10 random addition sequence; 단, gapmode = missing일때는 10 random addition sequence에서 각 step마다 시간제한 10초로 설정하였으며, 그 대신 5000 replicates 수행함).
- 전체 게놈 DNA는 신선한 잎 또는 건조된 표본을 사용하여, Allen et al. (2006)의 방법을 수정하여 추출하였다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain, reaction; PCR)은 Taberlet et al.
- , 2007)를 이용하여 정렬하였다. 정렬된 데이터는 Geneious pro를 사용하여 적절하지 않은 indels 부분을 수정하였다. tRNALeu(UAA) intron과 IGS 염기서열의 annotation은 DOGMA (Dual Organellar GenoMe Annotator) (Wyman et al.
데이터처리
- 계통수 제작은 PAUP* v4.0b10 (Swofford, 2003)을 이용하여 Maximun Parsimony (MP) 분석을 수행하였고, MrBayes v3.2.1 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)를 이용하여 Bayesian Inference (BI) 분석을 수행하였다. 분자진화모델은 jModeltest v0.
이론/모형
- 5 (Rambaut and Drummond, 2009)을 사용하여 effective sample size (ESS)값을 기초로 convergence을 확인 후 초기 10% burn-in한 후 50% majority rule consensus tree와 posterior probabilities (PP)를 평가하였다. Indels character state distributions의 최적화는 MacClade v4.08 (Maddison and Maddison, 2005)을 이용하였다.
- MP 분석은 gaps를 결여형질상태(gapmode = missing)와 제5의 형질상태(gapmode = newstate)로 각각 취급하여 heuristic searches (1000 random addition sequence replications, TBR branch swapping, ACCTRAN, MulTrees) 방법으로 분석하였다. 모든 형질은 ‘equal weight’를 주었고, Consistency index (CI; Kluge and Farris, 1969), Retention index (RI; Farris, 1989)와 Rescaled consistency index (RC)을 산출하였다.
- 1 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)를 이용하여 Bayesian Inference (BI) 분석을 수행하였다. 분자진화모델은 jModeltest v0.1.1 (Posada, 2008)을 사용하여 Akaike information criterion (AIC) 값을 선택하여 BI 분석에 파티션 별로 적용하였다.
- 분자진화의 중립성 검증(neutrality test)은 DnaSP v5.1 (Librado and Rozas, 2009)을 이용하여 Tajima’s statistic D 값을 산출하였고, Tandem Repeats 지역은 Tandem Repeats Finder (Benson, 1999)을 사용하여(alignment parameters 2, 3, 5, and minimum alignment score 40) 확인하였다.
- 염기서열은 Geneious pro v5.5 (Drummond et al., 2011)를 이용하여 조합하였고, 완성된 염기서열은 ClustalX v2.1 (Larkin et al., 2007)를 이용하여 정렬하였다. 정렬된 데이터는 Geneious pro를 사용하여 적절하지 않은 indels 부분을 수정하였다.
- 중합효소연쇄반응(Polymerase chain, reaction; PCR)은 Taberlet et al. (1991)에 의해 제작된 프라이머 ‘c’, ‘d’, ‘e’, ‘f’를 사용하였다.
- , 2007) 후 유합하여 자료를 만들어 각각 분석하여 비교하였다. 코딩된 자료의 모델은 morphological data (standard discrete model)처럼 Lewis (2001)에 기초하여 dataset에 적용하였다. 각각 Markov chain 5,000,000 generations를 반복하여, 매 500 generations마다 tree를 저장하였다.
성능/효과
- 3, Table 3). BI 분석결과, 기본값으로 분석한 계통수는 indels를 결여형질로 취급한 MP 계통수(Fig. 2A)와 동일한 topology로 나타났으며, 기본값 계통수보다 gaps를 형질로 처리한 계통수가 절간, 종간 해상력이 더 높았다(Fig. 4). Indels를 코딩하여 유합한 자료로 나타난 베이시안 계통수로부터 형질의 변화(Unambiguous changes only)를 추적하였다(Fig.
- 2). BI 분석에서 37개의 indel events를 MCIC 방법으로 코딩한 결과 11개의 이원형질들과 10개의 다원형질들로 구성된 자료행렬로 나타났다(Fig. 3, Table 3). BI 분석결과, 기본값으로 분석한 계통수는 indels를 결여형질로 취급한 MP 계통수(Fig.
- 3배 더 높았다(Table 1). Indels sites는 trnL-F IGS가 86 sites, trnL intron이 62 sites로 trnL-F IGS가 더 많았지만, indels events는 trnL intron에서 더 많이 발생하였고, indels 다양성 또한 trnL intron에서 높았다(Table 1). Tajima’s D의 중립성 검증 결과 trnL intron과 trnL-F IGS 지역에서 모두 P > 0.
- trnL-F IGS 지역이 trnL intron 지역에 비해 계통학적으로 유용한 지역이 많은 것으로 나타났다. Indels을 결여형질상태로 취급한 자료인 경우 최대절약분석 결과 82773개의 most parsimonious trees (length = 102 steps, CI = 0.922, RI = 0.954, RC = 0.879)을 얻었으며, indels를 제 5의 형질상태로 취급한 자료인 경우 최대절약분석 결과 3개의 most parsimonious trees (length = 275 steps, CI = 0.880, RI = 0.954, RC = 0840)을 얻었다. 이들의 strict consensus tree는 Fig.
- Indels을 제5의 형질로 취급한 한 자료는 계통학적으로 유용한 sites가 14.14%로 indels을 결여형질로 취급한 자료(3.72%)보다 10.42%가 상승하는 효과를 가지고 있으며, Indels을 제5의 형질상태로 취급한 계통수와 결여형질상태로 취급한 계통수를 비교했을 때도 더 유용한 것으로 판단된다. 그러나, CI 값은 indels를 결여형질상태로 취급한 분석에서 더 높았으며, 이것은 몇몇 indels 형질이 homoplastic indels로 충돌이 일어났음을 나타내고 있다.
- MP 분석 결과 indels를 결여형질로 취급한 자료인 경우 계통학적으로 유용한 sites가 trnL intron에서는 15(2.5%)이고, trnL-F IGS에서는 25(5.8%)으로 나타났다. 한편, indels를 제 5의 형질로 취급한 한 자료인 경우 계통학적으로 유용한 sites가 각각 85(14.
- Tajima’s D의 중립성 검증 결과 trnL intron과 trnL-F IGS 지역에서 모두 P > 0.1로 나타났으며, 이에 따라 귀무가설이 채택되었다(Table 1).
- 1, Table 1). trnL intron과 trnL-F IGS 지역의 길이와 GC content는 종간 변이가 다양하게 나타났고, trnL-F IGS보다 trnL intron 지역이 다양한 변이의 폭을 가지고 있지만, 뉴클레오티드 다양성은 trnL-F IGS 지역이 trnL intron지역보다 2.3배 더 높았다(Table 1). Indels sites는 trnL-F IGS가 86 sites, trnL intron이 62 sites로 trnL-F IGS가 더 많았지만, indels events는 trnL intron에서 더 많이 발생하였고, indels 다양성 또한 trnL intron에서 높았다(Table 1).
- 7%)으로 높게 나타났다(Table 1). trnL-F IGS 지역이 trnL intron 지역에 비해 계통학적으로 유용한 지역이 많은 것으로 나타났다. Indels을 결여형질상태로 취급한 자료인 경우 최대절약분석 결과 82773개의 most parsimonious trees (length = 102 steps, CI = 0.
- 6254이다. 결과적으로 한국산 꿩의다리속의 엽록체 trnL-F 지역 염기치환은 transition보다 transversion을 통해 진행되는 것으로 판단된다.
- 3에 나타냈다. 산꿩의다리절(그늘꿩의다리 제외)이 높은 확실성(BS 100%, JK 100%/BS 96%, JK 95%)을 가지며 유집되어 가장 먼저 분기한 것으로 나타났고, 이후 발톱꿩의다리와 나머지 clade groups로 분기하였다(Fig. 2). BI 분석에서 37개의 indel events를 MCIC 방법으로 코딩한 결과 11개의 이원형질들과 10개의 다원형질들로 구성된 자료행렬로 나타났다(Fig.
- 4). 한국산 꿩의다리속 안에서 추론된 indels evolution은 부분적인 분계조들의 공동파생형질이거나 몇몇 종의 단독파생형질로 나타났다(Fig. 4).
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