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문제 정의
- 본 연구에서는 클로자핀이 뇌 인슐린 작용을 억제함을 확인하였다. 클로자핀은 개별 세포 수준에서의 작용을 넘어서 뇌를 통해 전체 생체 수준에서 인슐린 저항성을 유발할 수 있음이 시사된다.
- 본 연구에서는 흰쥐 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 혈당 및 시상하부 Akt 인산화 변화에 클로자핀 처치가 미치는 영향을 분석하였다. 이를 통해 클로자핀이 뇌 인슐린 작용에 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구에서는 흰쥐 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 혈당 및 시상하부 Akt 인산화 변화에 클로자핀 처치가 미치는 영향을 분석하였다. 이를 통해 클로자핀이 뇌 인슐린 작용에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 1：2000으로 희석한 phospho-Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Akt, β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체 및 1：1000으로 희석한 horseradish peroxidase 결합 2차 항체를 이용하였으며, ECL-detection reagent(Amersham, Bucks, UK)로 발광하게 한 후 X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다.
- 20)21) 케타민(40 mg/kg, Yuhan, Seoul, Korea) 및 자일라진(xylazine 18.64 mg/kg, Bayer, Seoul, Korea)을 주사하여 흰쥐를 마취하고 정위 기구(Narishige, Tokyo, Japan)에 고정하였다. 두피를 절개하고 드릴을 통해 두개골의 구멍을 뚫고, 측뇌실 정위 좌표(Bregma coordinates : AP -1 mm, ML 2.
- 64 mg/kg, Bayer, Seoul, Korea)을 주사하여 흰쥐를 마취하고 정위 기구(Narishige, Tokyo, Japan)에 고정하였다. 두피를 절개하고 드릴을 통해 두개골의 구멍을 뚫고, 측뇌실 정위 좌표(Bregma coordinates : AP -1 mm, ML 2.5 mm, DV 3.5 mm)에 맞추어 제작한 도관(Plastics One, Roanoke, VA, USA)을 삽입하였다. 흰쥐는 수술 후 1주일간 회복 기간을 가진 후 실험에 사용되었다.
- 또한 뇌실로 주입한 인슐린은 시상하부에서 Akt 인산화 증가를 유발하였으며, 이 역시 클로자핀 전처치가 억제하였다. 이를 통해 클로자핀의 뇌 인슐린 반응에 대한 길항 작용을 확인하였다.
- Natick, MA, USA)에 녹여, 마이크로 펌프(KD Scientific, Holliston, MA, USA)를 이용하여 5 μL의 부피로 1분동안 도관을 통해 측뇌실로 주입하였다. 인슐린 뇌실 주사 농도는 뇌 인슐린 작용 관련 문헌의 실험 조건에 근거하여 결정하였다.19)
- 전기영동 및 면역블롯은 본 연구진의 이전 논문에 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.20)21) 10% polyacrylamide 젤을 사용하였으며, 각 lane당 총 단백질 양으로 50 μg의 시료를 사용하였다.
- 클로자핀 (20 mg/kg)은 복강 주사하였으며, 인슐린(100 mU)은 뇌실 도관을 통해 주입하였다. 대조군 평균 혈당은 138.
- 0으로 조정하였다. 클로자핀 10 또는 20 mg/kg을 흰쥐의 복강 내로 주사하였다. 인슐린 (100 mU, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)은 인공뇌척수액(Harvard Apparatus, S.
- 클로자핀 또는 0.3% tartaric acid를 복강 주사하고 1시간 30분 후에 인슐린 또는 인공뇌척수액을 뇌실 주입하였으며, 그로부터 30분 후 흰쥐를 단두 희생하여 뇌를 적출하고, 몸체의 혈액을 받아 혈당 측정기(CONTOUR TS Blood Glucose Meter, Bayer, Seoul, Korea)를 이용하여 혈당을 측정하였다(Fig. 1).
- 클로자핀의 뇌 인슐린 작용에 대한 영향과 시상하부의 관련성을 조사하기 위해 Akt 인산화를 조사하였다. Akt의 Ser473 잔기 인산화는 인슐린에 의한 Akt 효소 활성을 반영한다.
- 흰쥐에 클로자핀 (10, 20 mg/kg) 또는 tartaric acid를 복강 내로 주사하고 2시간 후 혈당을 측정하였다. 측정된 혈당(평균 ± 표준편차)은 다음과 같다.
대상 데이터
- 20)21) 10% polyacrylamide 젤을 사용하였으며, 각 lane당 총 단백질 양으로 50 μg의 시료를 사용하였다.
- 17) 이와 관련하여 여자 흰쥐가 더 유용한 실험 조건으로 시사되기도 하였다.37) 본 실험에서는 남자 흰쥐를 사용하였다. 본 연구에서도 클로자핀 10 mg/kg은 혈당의 증가를 유발하지 않았지만, 20 mg/kg 주사 2시간 후 유의한 혈당 증가를 확인할 수 있었다.
- 동일한 실험 조건에서 사육한 체중 200~250 g의 SpragueDawley 수컷 흰쥐를 사용하였다. 실험동물은 사육실에 반입된 후 1주일의 적응 기간을 가졌으며, 12/12시간 명암주기 하에서 먹이와 물을 자유롭게 섭취하였다.
- 인슐린 (100 mU, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)은 인공뇌척수액(Harvard Apparatus, S. Natick, MA, USA)에 녹여, 마이크로 펌프(KD Scientific, Holliston, MA, USA)를 이용하여 5 μL의 부피로 1분동안 도관을 통해 측뇌실로 주입하였다.
- 5 mm)에 맞추어 제작한 도관(Plastics One, Roanoke, VA, USA)을 삽입하였다. 흰쥐는 수술 후 1주일간 회복 기간을 가진 후 실험에 사용되었다.
데이터처리
- 1：2000으로 희석한 phospho-Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Akt, β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체 및 1：1000으로 희석한 horseradish peroxidase 결합 2차 항체를 이용하였으며, ECL-detection reagent(Amersham, Bucks, UK)로 발광하게 한 후 X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다. 면역 블롯 신호는 TINA program version 2.10 G(Raytest, Straubenhardt, Germany)을 이용하여 정량화하였으며, Akt 인산화 값은 Akt 전체 단백질 값에 대한 비율을 구하여 통계 분석에 사용하였다.
- 혈당 수치 및 정량화된 면역 블롯 신호 값을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 일원분산분석을 수행하고, Tukey 사후 분석을 통해 각 군 간의 차이를 분석하였다. 통계분석은 SPSS for Windows version 19.
- 혈당 수치 및 정량화된 면역 블롯 신호 값을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 일원분산분석을 수행하고, Tukey 사후 분석을 통해 각 군 간의 차이를 분석하였다.
이론/모형
- 실험동물은 사육실에 반입된 후 1주일의 적응 기간을 가졌으며, 12/12시간 명암주기 하에서 먹이와 물을 자유롭게 섭취하였다. National Institute of Health 실험 동물 윤리 지침에 기반하여 실험을 수행하였다.
- 뇌실내 삽관은 본 연구진의 이전 논문에 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.20)21) 케타민(40 mg/kg, Yuhan, Seoul, Korea) 및 자일라진(xylazine 18.
성능/효과
- 그러나 비정형 항정신병약물은 체중 증가, 지질 및 당 조절 이상과 같은 대사 부작용을 유발하며, 이는 장기 유지 치료의 큰 장애물로 작용한다.1) 대사 부작용의 하나로서 비정형 항정신병약물은 제2형 당뇨병 발병의 위험을 증가시킨다.1-5) 비정형 항정신병약물은 정형 항정신병약물에 비하여 유의하게 당뇨병의 유병률을 증가시켰으며,5) 클로자핀 투여 중인 조현병 및 조현정동장애 환자를 10년간 추적한 결과, 43%의 환자에서 새롭게 당뇨병이 발생하였다.
- 인슐린은 인슐린 수용체를 통해 Akt를 포함한 하위 인산화 효소의 활성 변화를 유발하며, glucose transporter(이하 GLUT)의 세포막 이동을 유발하여 세포 내로 당 유입을 증가시킨다.10) 클로자핀은 인슐린에 의한 세포의 당 유입을 억제하였다.11)12) 또한 클로자핀은 인슐린에 의한 Akt 및 인슐린 수용체의 주요 하위 조절자인 insulin receptor substrate(이하 IRS)의 인산화 변화에 영향을 주며, GLUT 발현 변화를 유발한다고 보고되기도 하였다.
- 22) 클로자핀 및 인슐린 처치에 의해 Akt 인산화는 유의하게 변화하였으며(F = 10.811, p = 0.001), Akt 전체 단백질의 변화는 없었다.
- 24-26)혈중 호르몬 및 영양분은 시상하부의 궁상핵(arcuate nucleus)에 작용하여 당 대사에 영향을 준다.27) 궁상핵에는 세포토닌 및 도파민 수용체 등의 다양한 신경전달물질 수용체가 충분히 발현되고 있어서 비정형 항정신병약물 유발성 대사 부작용의 중심 표적이 될 수 있다.28) 클로자핀 처치는 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 혈당 강하 작용을 억제하였으며, 이는 클로자핀이 시상하부에서 인슐린 작용을 억제함을 시사한다.
- 27) 궁상핵에는 세포토닌 및 도파민 수용체 등의 다양한 신경전달물질 수용체가 충분히 발현되고 있어서 비정형 항정신병약물 유발성 대사 부작용의 중심 표적이 될 수 있다.28) 클로자핀 처치는 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 혈당 강하 작용을 억제하였으며, 이는 클로자핀이 시상하부에서 인슐린 작용을 억제함을 시사한다.
- 대조군 평균 혈당은 138.40 ± 10.36 mg/dL, 클로자핀 단독 처치 군은 188.80 ± 20.07 mg/dL, 인슐린 단독 처치군은 111.40 ± 6.88 mg/dL, 클로자핀 및 인슐린 처치 군에서는 150.20 ± 21.65 mg/dL이었다.
- 본 연구에서 클로자핀은 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 흰쥐의 혈당 저하를 억제하였다. 또한 뇌실로 주입한 인슐린은 시상하부에서 Akt 인산화 증가를 유발하였으며, 이 역시 클로자핀 전처치가 억제하였다. 이를 통해 클로자핀의 뇌 인슐린 반응에 대한 길항 작용을 확인하였다.
- 본 연구에서 클로자핀은 뇌실로 주입한 인슐린에 의한 흰쥐의 혈당 저하를 억제하였다. 또한 뇌실로 주입한 인슐린은 시상하부에서 Akt 인산화 증가를 유발하였으며, 이 역시 클로자핀 전처치가 억제하였다.
- 37) 본 실험에서는 남자 흰쥐를 사용하였다. 본 연구에서도 클로자핀 10 mg/kg은 혈당의 증가를 유발하지 않았지만, 20 mg/kg 주사 2시간 후 유의한 혈당 증가를 확인할 수 있었다. 본 연구와 동일한 Sprague-Dawley 남자 흰쥐에서 20 mg/kg에 의한 급성 혈당 증가가 보고되기도 하여서,38) 이는 클로자핀의 혈당 증가 기전 연구를 위한 유효한 실험 조건으로 생각된다.
- 005). 사후 분석 결과, 클로자핀 20 mg/kg 군에서 대조군에 비해 유의하게 혈당이 높았다(p = 0.002)(Fig. 2).
- 002). 인슐린 뇌실 주입은 대조군에 비해 유의하게 혈당을 감소시켰으며(p = 0.018), 클로자핀을 주사한 후 인슐린을 뇌실로 주입한 경우, 인슐린 단독 처치 군에 비하여 유의하게 혈당이 높았다(p = 0.024)(Fig. 3).
- 001)은 각각 시상하부에서 Akt Ser473 잔기 인산화의 유의한 증가를 유발하였다. 클로자핀을 주사한 후 인슐린을 뇌실 주입한 군의 Akt 인산화 수준은 인슐린 뇌실 단독 처치 군에서의 Akt 인산화 수준에 비해서 유의하게 낮았다(p = 0.010)(Fig. 4).
- 클로자핀이 세포 분자 수준에서 직접 인슐린 저항성을 유발함이 알려졌다. 인슐린은 인슐린 수용체를 통해 Akt를 포함한 하위 인산화 효소의 활성 변화를 유발하며, glucose transporter(이하 GLUT)의 세포막 이동을 유발하여 세포 내로 당 유입을 증가시킨다.
후속연구
- 39) 한편 조현병 환자의 대사 부작용에는 약물 복용뿐 아니라 다양한 환경적 요인 및 유전적 요인이 함께 관여하는 것으로 보인다.1)40-42) 따라서 항정신병약물에 의한 대사 부작용 유발 기전에 대한 연구는 새로운 치료 작용 기전 및 조현병 병태생리 이해 증진에도 도움이 될 것이다.
- 클로자핀은 개별 세포 수준에서의 작용을 넘어서 뇌를 통해 전체 생체 수준에서 인슐린 저항성을 유발할 수 있음이 시사된다. 향후 세부 분자 기전 및 비정형 항정신병약물의 시상하부를 통한 다양한 대사 지표 이상 기전에 대한 확장 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 22)23) 클로자핀은 시상하부에서 인슐린에 의해 유발된 Akt 인산화를 감소시켰다. 향후 클로자핀에 의한 식욕 및 체중 증가 등에 대한 영향에 있어서도 시상하부 인슐린 억제 작용의 관련성 분석이 필요할 것으로 생각된다. 한편, 클로자핀의 흰쥐 뇌 및 다양한 세포주에서 Akt 활성화가 보고되었다.
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