Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a key role in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis including induction of endothelial cell proliferation, migration and capillary tube formation. E7080 (S1164, Selleck chemical, Houston, TX, USA) is a muti-targeted kinase inhibitor, which ...
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a key role in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis including induction of endothelial cell proliferation, migration and capillary tube formation. E7080 (S1164, Selleck chemical, Houston, TX, USA) is a muti-targeted kinase inhibitor, which targets VEGF receptor-2, 3 (VEGFR-2, 3) and inhibits survival and proliferation of tumor cell. The purpose of this study was to determine the anti-tumor effect of E7080 on oral squamous cell carcinoma. Methods: An oral squamous cell carcinoma cell line, SCC-9 was used in this study. E7080 was applied to SCC-9 cells by 3 different concentrations (1, 5, 10 ${\mu}g/mL$). Control means no application of E7080. The cellular growth was evaluated by real-time cell electronic sensing and MTT assay. The signal transduction was evaluated by Western blotting. Results: In experimental group, SCC-9 cell proliferation was decreased and the VEGFR-3 downstream pathways were inhibited compared with control. Furthermore, increasing the concentration of E7080, the ability of E7080 to disturbance of SCC-9 cell proliferation was increased. Conclusion: Proliferation of SCC-9 cells was inhibited by E7080, which was through by inhibition of VEGFR-3 downstream pathway. In vivo study with E7080 will be required to provide therapeutic benefits in oral squamous cell carcinoma.
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a key role in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis including induction of endothelial cell proliferation, migration and capillary tube formation. E7080 (S1164, Selleck chemical, Houston, TX, USA) is a muti-targeted kinase inhibitor, which targets VEGF receptor-2, 3 (VEGFR-2, 3) and inhibits survival and proliferation of tumor cell. The purpose of this study was to determine the anti-tumor effect of E7080 on oral squamous cell carcinoma. Methods: An oral squamous cell carcinoma cell line, SCC-9 was used in this study. E7080 was applied to SCC-9 cells by 3 different concentrations (1, 5, 10 ${\mu}g/mL$). Control means no application of E7080. The cellular growth was evaluated by real-time cell electronic sensing and MTT assay. The signal transduction was evaluated by Western blotting. Results: In experimental group, SCC-9 cell proliferation was decreased and the VEGFR-3 downstream pathways were inhibited compared with control. Furthermore, increasing the concentration of E7080, the ability of E7080 to disturbance of SCC-9 cell proliferation was increased. Conclusion: Proliferation of SCC-9 cells was inhibited by E7080, which was through by inhibition of VEGFR-3 downstream pathway. In vivo study with E7080 will be required to provide therapeutic benefits in oral squamous cell carcinoma.
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문제 정의
추가적으로 E7080이 VEGFR-3의 downstream pathway에도 영향을 주는지 결정하기 위해서 관련 인자 들에 대한 Western blot을 시행하였다. VEGFR-3의 인산화는 세포의 생존, 증식, 이주, 세포투과성과 관련된 신호전달체계들을 활성화시키는데 본 연구에서는 특히 세포의 생존과 증식에 관련된 akt와 c-jun 인산화 효소 신호전달체계에 E7080이 어떠한 영향을 주는지에 대하여 확인하였다[40]. 결과적으로 E7080은 akt와 c-jun 인산화 효소 신호전달체계를 억제하였고 농도가 증가할수록 그 억제 능력 역시 증가함을 알 수 있었다.
본 연구는 구강 편평상피세포암 세포주인 SCC-9에 대한 VEGFR 억제제의 영향을 결정하기 위하여 시행되었다. 본 실험에서 E7080을 투여한 군에서는 대조군에 비해서 종양세포의 증식이 억제되는 양상을 보였고, E7080의 농도가 증가함에 따라 세포증식의 억제 능력도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
그러므로 신생혈관 형성 및 림프관 신형성을 방해하는 것은 암종의 치료에 있어서 매우 중요한 전략이 될 수 있다. 저자는 E7080이 구강 편평상피세포암종 세포주인 SCC-9 종양세포의 증식에 어떠한 영향을 미치는지 in vitro 연구를 통하여 알아보기로 하였다.
제안 방법
Western blot 분석법에서 대조군과 실험군들 간의 상대적인 밴드 두께의 비교는 Image Lab software (Bio-Rad)를 통하여 분석하였고 β-actin 밴드의 두께를 기준으로 하여 anti- phospho-c-jun과 anti-phospho-Akt를 항체로 하여 확인된 밴드의 두께를 상대적으로 분석하고 정량화하였다.
그 후 E7080을 1, 5, 10 μg/mL 농도로 투여한 배양액을 넣고 37℃에서 두 군으로 나누어 각 군마다 24시간, 48시간 동안 반응하도록 하였다.
마찬가지로 4개의 그룹으로 나누어 아무것도 첨가하지 않은 대조군과 각각 1, 5, 10 μg/mL의 E7080을 첨가한 그룹으로 나누어 검출하였다.
분주 8시간 경과 후 4개의 그룹으로 나누어 대조군과 E7080을 5, 10, 20 μg/mL의 농도로 투여한 배양액을 첨가하여 37℃에서 56시간 동안 RT-CES system을 통하여 관찰하였다.
종양세포를 배양액 100 μL당 2×103개가 되도록 96-well plate에 분주하고 세포 증식을 RT-CES system (ACEA biosciences, San Diego, CA, USA)을 통하여 관찰하였다.
1차 항체 모두 TBS-T buffer에 1:1,000으로 희석한 다음에 상온에서 90분간 배양한 후 HRP-conjugated secondary antibodies(1:5,000 dilution; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 표적 단백질은 ChemiDoc (BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 검출하였다. 마찬가지로 4개의 그룹으로 나누어 아무것도 첨가하지 않은 대조군과 각각 1, 5, 10 μg/mL의 E7080을 첨가한 그룹으로 나누어 검출하였다.
대상 데이터
이와 같이 외국의 연구들에서 E7080의 효과와 작용이 입증되어 왔지만, 구강내 편평상피세포암종에 대한 연구는 거의 보고된 바가 없으며 따라서 임상적인 적용 역시 아직 시도되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 E7080을 구강 편평상피세포암종 세포 주인 SCC-9에 적용하였다. RT-CES와 MTT 분석 결과 E7080투여 후 SCC-9 세포주의 증식이 억제되는 양상을 관찰할 수 있었고, E7080의 농도가 증가함에 따라 종양세포 증식 억제능이 증가됨이 확인되었다.
세포배양은 10% 우태혈청(fetal bovine albumin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 units/mL penicillin (invitrogen) 및 100 mg/mL streptomycin (Invitrogen)을 포함한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Invitrogen)을 사용하였다.
인간의 구강 편평상피세포암종에서 채취한 SCC-9 (human tongue carcinoma; ATCC; Manassas, VA, USA) 세포주가 본 실험에 이용되었다. 세포배양은 10% 우태혈청(fetal bovine albumin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 units/mL penicillin (invitrogen) 및 100 mg/mL streptomycin (Invitrogen)을 포함한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Invitrogen)을 사용하였다.
혈관내피성장인자 수용체 억제제로는 Selleck chemical 회사에서 합성된 S1164, 즉 4-[3-Chloro-4-(N-cyclopropylureido)phenoxy]-7-methoxyquinoline-6-carboxmide (E7080)이 사용되었다. In vitro에서 E7080 (10 mmol/L)의 모액(stock solution)은 dimethyl sulfoxide에 준비하였고 -20℃에서 보관하였으며 사용 전에 배지와 함께 희석시켰다.
데이터처리
RT-CES를 통한 분석은 E7080을 투여한 후 12시간 간격으로 측정한 cell index 값을 평균으로 하여 Excel의 independent t-test를 이용하여 통계처리를 하였다. MTT assay 시 흡광도(optical density)는 550 nm 파장에서 분광광도계를 이용하여 측정하였고, 3번 측정한 값을 수치화한 후 평균값의 비교는 Microsoft Excel의 independent t-test를 이용하여 통계 처리하였다. 통계 분석 시 0.
RT-CES로 관찰한 세포의 증식은 Microsoft Excel (Microsoft, Seattle, WA, USA) 프로그램을 통하여 그래프로 나타내었다. RT-CES를 통한 분석은 E7080을 투여한 후 12시간 간격으로 측정한 cell index 값을 평균으로 하여 Excel의 independent t-test를 이용하여 통계처리를 하였다.
RT-CES로 관찰한 세포의 증식은 Microsoft Excel (Microsoft, Seattle, WA, USA) 프로그램을 통하여 그래프로 나타내었다. RT-CES를 통한 분석은 E7080을 투여한 후 12시간 간격으로 측정한 cell index 값을 평균으로 하여 Excel의 independent t-test를 이용하여 통계처리를 하였다. MTT assay 시 흡광도(optical density)는 550 nm 파장에서 분광광도계를 이용하여 측정하였고, 3번 측정한 값을 수치화한 후 평균값의 비교는 Microsoft Excel의 independent t-test를 이용하여 통계 처리하였다.
이론/모형
3-(4,5-dimthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)를 이용한 분석법을 사용하여 진행하였다. 우선 종양세포를 배양액 100 μL당 2×103개가 되도록 각각의 96-well plate에 분주하고 24시간 동안 배양하였다.
E7080이 SCC-9 세포주의 VEGFR-3의 downstream pathway에 미치는 영향에 대하여 조사하기 위해 anti-phospho-Akt와 anti-phospho-c-jun 항체로 Western blot을 시행하였다. β-actin을 표준화된 값으로 하여 비교한 결과 akt와 c-jun이 결합된 단백질 밴드의 두께가 대조군에 비하여 실험군에서 더 얇게 나타났다.
RT-CES와 MTT 분석 결과 E7080투여 후 SCC-9 세포주의 증식이 억제되는 양상을 관찰할 수 있었고, E7080의 농도가 증가함에 따라 종양세포 증식 억제능이 증가됨이 확인되었다. 추가적으로 E7080이 VEGFR-3의 downstream pathway에도 영향을 주는지 결정하기 위해서 관련 인자 들에 대한 Western blot을 시행하였다. VEGFR-3의 인산화는 세포의 생존, 증식, 이주, 세포투과성과 관련된 신호전달체계들을 활성화시키는데 본 연구에서는 특히 세포의 생존과 증식에 관련된 akt와 c-jun 인산화 효소 신호전달체계에 E7080이 어떠한 영향을 주는지에 대하여 확인하였다[40].
성능/효과
실험이 종료되었을 때 전반적으로 대조군에 비하여 실험군에서 SCC-9 세포주의 증식이 억제된 양상을 나타내었으나 통계적인 유의성은 20 μg/mL를 투여한 군에서만 나타났다. E7080 농도가 증가할수록 SCC-9 세포주의 증식 억제도 이에 비례하여 증가된 양상을 보였다(Fig. 1).
E7080을 투여한 실험군과 대조군에서의 24시간과 48시간에 흡광도를 조사한 결과 대조군에서 실험군에 비하여 높은 흡광도를 보였다. 실험군에서는 E7080의 농도가 증가할수록 이에 반비례하여 흡광도는 낮아지는 양상을 보였는데, 특히 5 μg/mL와 10μg/mL의 E7080을 투여한 군에서는 통계적으로 유의하게 낮은 흡광도 값을 나타내었다(Fig.
본 연구에서는 E7080을 구강 편평상피세포암종 세포 주인 SCC-9에 적용하였다. RT-CES와 MTT 분석 결과 E7080투여 후 SCC-9 세포주의 증식이 억제되는 양상을 관찰할 수 있었고, E7080의 농도가 증가함에 따라 종양세포 증식 억제능이 증가됨이 확인되었다. 추가적으로 E7080이 VEGFR-3의 downstream pathway에도 영향을 주는지 결정하기 위해서 관련 인자 들에 대한 Western blot을 시행하였다.
VEGFR-3의 인산화는 세포의 생존, 증식, 이주, 세포투과성과 관련된 신호전달체계들을 활성화시키는데 본 연구에서는 특히 세포의 생존과 증식에 관련된 akt와 c-jun 인산화 효소 신호전달체계에 E7080이 어떠한 영향을 주는지에 대하여 확인하였다[40]. 결과적으로 E7080은 akt와 c-jun 인산화 효소 신호전달체계를 억제하였고 농도가 증가할수록 그 억제 능력 역시 증가함을 알 수 있었다.
β-actin을 표준화된 값으로 하여 비교한 결과 akt와 c-jun이 결합된 단백질 밴드의 두께가 대조군에 비하여 실험군에서 더 얇게 나타났다. 또한 E7080의 농도가 증가할수록 phospho-akt와 c-jun 모두에서 밴드의 두께가 점점 얇아지는 것으로 분석되었다(Fig. 3, 4).
본 연구는 구강 편평상피세포암 세포주인 SCC-9에 대한 VEGFR 억제제의 영향을 결정하기 위하여 시행되었다. 본 실험에서 E7080을 투여한 군에서는 대조군에 비해서 종양세포의 증식이 억제되는 양상을 보였고, E7080의 농도가 증가함에 따라 세포증식의 억제 능력도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 다양한 수용체 인산화효소의 억제효과를 가진 E7080은 특히 VEGFR-3의 downstream pathway를 차단하여 종양세포의 증식을 억제함을 Western blot을 통한 분석에서 추정해 볼 수 있었다.
세포 배양 8시간째에 E7080을 투여한 후부터 각 군마다 증식곡선의 차이를 보였는데 약을 투여한 후 12시간째에서는 5, 10, 20 μg/mL를 투여한 세 군 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 cell index 값이 감소하였다.
실험군에서는 E7080의 농도가 증가할수록 이에 반비례하여 흡광도는 낮아지는 양상을 보였는데, 특히 5 μg/mL와 10μg/mL의 E7080을 투여한 군에서는 통계적으로 유의하게 낮은 흡광도 값을 나타내었다(Fig. 2).
실험이 종료되었을 때 전반적으로 대조군에 비하여 실험군에서 SCC-9 세포주의 증식이 억제된 양상을 나타내었으나 통계적인 유의성은 20 μg/mL를 투여한 군에서만 나타났다.
특히 akt와 JNK의 인산화는 세포의 생존과 증식에 있어서 매우 중요한 요소로 이것의 차단은 세포의 증식억제와 사멸(apoptosis)을 의미한다[40]. 이는 종양의 표적 치료를 위한 중요한 단서를 제공하며 본 실험의 결과를 통해 추론해 보았을 때, 구강암 세포주인 SCC-9 종양 세포막에는 VEGFR이 발현되며 E7080이 구강 편평상피세포암에 대한 항종양 치료제로서 가능성을 보여줄 수 있다고 생각한다.
후속연구
VEGFR-3는 특히 신생 림프관 형성에 중요한 역할을 하는 수용체로서 E7080은 VEGFR-3를 차단하여 암종의 신생 림프관 형성을 억제함으로써 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다[7,18]. 따라서 림프절로의 전이 성향이 강한 구강 편평상피세포암에 대해서 E7080이 효과를 나타낸다면 이는 새로운 표적치료제로 사용될 수 있을 것이고 구강암의 경부 림프절 전이와 원격 장기로의 전이를 억제시켜서 결국 환자의 생존율을 높이고 삶의 질을 향상시키는 데 기여할 수 있을 것으로 생각한다.
추후 E7080의 SCC-9에 대한 증식 억제에 관한 in vivo 실험 및 다른 구강편평상피세포암종 세포주에 대한 효과와 관련한 추가적인 실험이 필요할 것이라고 생각이 된다. 이와 같은 실험데이터의 축적과 적정 투여 용량에 대한 평가 및 약물의 부작용에 대한 임상실험 등이 시행된다면 앞으로 E7080을 통한 구강암의 항암치료가 가능하리라고 생각한다.
다양한 수용체 인산화효소의 억제효과를 가진 E7080은 특히 VEGFR-3의 downstream pathway를 차단하여 종양세포의 증식을 억제함을 Western blot을 통한 분석에서 추정해 볼 수 있었다. 추후 E7080의 SCC-9에 대한 증식 억제에 관한 in vivo 실험 및 다른 구강편평상피세포암종 세포주에 대한 효과와 관련한 추가적인 실험이 필요할 것이라고 생각이 된다. 이와 같은 실험데이터의 축적과 적정 투여 용량에 대한 평가 및 약물의 부작용에 대한 임상실험 등이 시행된다면 앞으로 E7080을 통한 구강암의 항암치료가 가능하리라고 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
암종의 신생혈관 및 림프관형성 능력은 어떻게 촉진되는가?
암종의 신생혈관 및 림프관형성 능력은 vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor, transforming growth factor-β (TGF-β) 등의 혈관형성자극인자의 발현에 의하여 촉진된다[1,2,6]. 그 중 VEGF는 가장 중요한 역할을 하는 성장인자로 종양세포를 포함한 다양한 세포에서 분비되며, 혈관 및 림프관 내피세포에 특이성이 있어 내피세포의 세포핵 분열을 촉진하고, 세포외 기질의 용해와 내피세포의 이동을 통해 혈관 및 림프관 형성에 기여한다고 알려져 있다[7-10].
신생 혈관 형성과 림프관 신형성이란?
신생혈관 형성(angiogenesis)과 림프관 신형성(lymphangiogenesis)은 기존에 존재하는 혈관계와 림프관계의 내피세포로부터 새로운 혈관과 림프관이 형성되는 과정으로 세포외 기질의 재형성과 내피세포의 이주 및 증식, 고리 형성, 모세혈관의 분화 및 혈관과 림프관의 문합 그리고 최종적으로 혈관 및 림프관 강이 형성되는 단계로 이루어진다[1,2]. 암종(carcinoma)의 신생 혈관 형성과 림프관 신형성은 암종의 성장과 전이에 있어서 필수적으로 진행되어야만 하는 과정이다[3,4].
암종의 특징은?
암종(carcinoma)의 신생 혈관 형성과 림프관 신형성은 암종의 성장과 전이에 있어서 필수적으로 진행되어야만 하는 과정이다[3,4]. 암종은 새로운 혈관과 림프관의 형성 없이는 2∼3 mm 이상의 크기로 성장할 수 없으며 또한 혈관 및 림프관의 형성은 종양세포의 순환계로의 침투를 용이하게 하여 원격전이를 일으키는 통로를 제공한다[5].
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