제주흑우 동결정액 제조 시 Low Density Lipoprotein (LDL)의 첨가가 동결 융해 후 정자의 성상에 미치는 영향 Effect of Low Density Lipoprotein (LDL) on Motility, Viability, Membrane Integrity and Acrosome Integrity of Frozen-thawed Sperm in Korean Jeju Black Bull원문보기
This study was designed to determine whether low-density lipoporoteins (LDL) extracted from egg yolk in extender improve the function of Korean Jeju Black Bull semen. The semen was cryopreserved with 5% ethylene glycol (EG) or 7% glycerol (G) extenders containing 10% egg yolk (EY), 4% LDL and 5% EY ...
This study was designed to determine whether low-density lipoporoteins (LDL) extracted from egg yolk in extender improve the function of Korean Jeju Black Bull semen. The semen was cryopreserved with 5% ethylene glycol (EG) or 7% glycerol (G) extenders containing 10% egg yolk (EY), 4% LDL and 5% EY or 8% LDL. Frozen-thawed sperm were evaluated sperm motility, viability, membrane integrity and acrosome integrity. Post-thawed sperm motility has been significantly higher (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY ($69.00%{\pm}4.18$; EG and $63.00%{\pm}9.75$; 7% G) than 8% LDL ($57.00%{\pm}5.70$; EG and $52.00%{\pm}4.47$;G). Treatment of 4% LDL + 5% EY-EG ($66.85%{\pm}5.06$) has been significantly improved sperm viability compared to other treatments except 10% EY - EG. Moreover, in membrane integrity, swollen sperm ratio has been only significantly increased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG ($64.65%{\pm}6.10$) among all treatments. In assess to detect acrosome integrity, especially, AR pattern ratio has been significantly decreased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG among all treatments. In sperm viability as time passes, between 4% LDL + 5% EY and 10% EY, there was no significant difference, but 8% LDL was significantly decreased sperm viability in EG (1 and 2 hrs) and G (30 min, 1, 2, 5 and 12 hrs) extender. However, there were no significant differences among all treatments except 8% LDL-G in sperm membrane integrity. 8% LDL-G has been significantly decreased swollen sperm ratio at 5 hrs after thawed. It is concluded from these results that 4% LDL + 5% EY to the freezing extender showed more positive effect on the frozen-thawed spermatozoa in Korean Jeju Black bull.
This study was designed to determine whether low-density lipoporoteins (LDL) extracted from egg yolk in extender improve the function of Korean Jeju Black Bull semen. The semen was cryopreserved with 5% ethylene glycol (EG) or 7% glycerol (G) extenders containing 10% egg yolk (EY), 4% LDL and 5% EY or 8% LDL. Frozen-thawed sperm were evaluated sperm motility, viability, membrane integrity and acrosome integrity. Post-thawed sperm motility has been significantly higher (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY ($69.00%{\pm}4.18$; EG and $63.00%{\pm}9.75$; 7% G) than 8% LDL ($57.00%{\pm}5.70$; EG and $52.00%{\pm}4.47$;G). Treatment of 4% LDL + 5% EY-EG ($66.85%{\pm}5.06$) has been significantly improved sperm viability compared to other treatments except 10% EY - EG. Moreover, in membrane integrity, swollen sperm ratio has been only significantly increased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG ($64.65%{\pm}6.10$) among all treatments. In assess to detect acrosome integrity, especially, AR pattern ratio has been significantly decreased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG among all treatments. In sperm viability as time passes, between 4% LDL + 5% EY and 10% EY, there was no significant difference, but 8% LDL was significantly decreased sperm viability in EG (1 and 2 hrs) and G (30 min, 1, 2, 5 and 12 hrs) extender. However, there were no significant differences among all treatments except 8% LDL-G in sperm membrane integrity. 8% LDL-G has been significantly decreased swollen sperm ratio at 5 hrs after thawed. It is concluded from these results that 4% LDL + 5% EY to the freezing extender showed more positive effect on the frozen-thawed spermatozoa in Korean Jeju Black bull.
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문제 정의
그럼에도 불구하고 LDL이 정자의 이동성이나 semen quality parameter와의 관련성에 대하여 알려진 바는 많지 않다. 따라서 본 연구에서는 보다 안정적인 동결정액의 제조를 위하여, 제주흑우의 동결정액 제조에 있어 LDL의 첨가가 동결-융해 후 정자의 성상에 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다.
본 연구는 희소 한우인 제주흑우의 성공적인 인공수정을 위한 효과적 동결 조건을 수립하기 위하여 제주흑우의 동결 정액 제조시 LDL을 첨가하여 동결-융해 후 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성 및 정자의 첨체 양상의 변화 조사를 위하여 수행되었다. 제주흑우의 정액을 동결 융해한 결과, ethylene glycol과 glycerol 기반의 4% LDL과 5% 난황을 첨가한 실험구에서 69.
제안 방법
0.9% NaCl 용액에 0.5% eosin-Y를 용해한 후 10μl의 정액을 slide glass 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어 도말한 다음 cover glass를 덮고 MicroLux 현미경(×70, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다.
5% eosin-Y를 용해한 후 10μl의 정액을 slide glass 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어 도말한 다음 cover glass를 덮고 MicroLux 현미경(×70, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다. 100배율에서 염색 상태를 관찰하여 표본 1개당 200개의 정자를 확인하여 붉게 염색된 죽은 정자의 비율을 계산하였으며, 개체 당 2개의 표본을 만들어 총 400개의 정자를 확인하여 생존율을 평가하였다.
37℃의 저장액(150 mOsm/kg, 0.45% NaCl 용액) 1 ml에 정자 샘플 100 μl를 혼합하여 37℃에서 5분간 정치시킨 후 slide glass에 도말하여 개체당 2개의 slide 표본을 만들어 표본당 200개의 정자를 확인하여 정자막의 온전성을 평가하였다.
동결된 정액은 LN2 tank에서 보관하였으며, 필요 시 융해하여 사용하였다. 동결정액의 융해는 공기 중에서 약 10초간 융해한 후 37℃ 온수에 20초간 침지시켜 융해한 후 정자의 생존율 및 정자 양상을 조사하였다.
본 실험에 이용된 보존액의 조성은 Table 1과 같으며, 동결 보호제로 7%의 glycerol과 5%의 ethylene glycol을 이용하였으며, 10%의 난황, 5%의 난황과 4%의 LDL 그리고 8%의 LDL을 첨가한 실험구를 비교하였다. LDL은 Moussa 등(2002)의 방법에 의해 제조하였다.
5% glutaradehyde를 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 염색 후 24시간 이내에 형광현미경 하에 판독하였다(IX 71, Olympus, Japan), 정자 첨체막 양상의 판독 기준은 Fraser (1995)의 분류를 따라 정자 두부가 전체적으로 형광 발광을 할 경우 수정능력획득이 일어나지 않은 F pattern으로, 적도면 부분에 띠가 형성되어 첨체 아랫부분에서 형광 발광을 할 경우 수정능력획득이 일어난 B pattern으로 구분하였으며, 마지막으로 정자 두부가 형광 발광을 하지 않거나, 얼룩덜룩한 발광을 할 경우 첨체반응이 일어난 AR pattern으로 구분하였다.
정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2～3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다. 승가가 이루어지면 수컷의 음경을 인공질에 삽입하여 정액을 채취하였다.
정액의 운동성 평가는 MicroLux 현미경(×70, Olympus, Japan)하에서 정자의 활력을 평가하였다.
정자막 온전성을 측정하기 위하여 Jeyendran 등(1984)의 방법을 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자 미부의 팽창 형태를 분석하였다(hypo-osmetic swelling test: HOST). 37℃의 저장액(150 mOsm/kg, 0.
혈구계산판에 5 μl의 정액을 놓고 cover glass로 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다.
혈구계산판에 5 μl의 정액을 놓고 cover glass로 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다. 혈구계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여 거의 모든 정자들이 소용돌이치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들을 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80개 이상일 때 80%로, 70개 이상일 때 70%로 판단하고, 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진 운동하거나 진자 운동 혹은 미동하는 수준일 때 30%로 평가하였다.
대상 데이터
정액 채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위하여 암컷을 안전하게 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주흑우 수컷을 2～3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다.
정액 채취에 이용된 흑우는 3세 이상의 수컷 6두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다.
데이터처리
통계 분석은 통계 분석 프로그램(SPSS version 18.0)을 이용하였으며, LDL의 첨가수준에 따른 동결 융해 후 정자의 활력 및 생존율과 첨체 및 정자막 온전성에 미치는 영향에 대한 결과는 ANOVA를 이용하여 분석하였으며, 최소유의차(LSD) 방법을 이용하여 각 처리구간의 유의성 (p<0.05)을 검증하였다.
이론/모형
본 실험에 이용된 보존액의 조성은 Table 1과 같으며, 동결 보호제로 7%의 glycerol과 5%의 ethylene glycol을 이용하였으며, 10%의 난황, 5%의 난황과 4%의 LDL 그리고 8%의 LDL을 첨가한 실험구를 비교하였다. LDL은 Moussa 등(2002)의 방법에 의해 제조하였다. 채취된 정액은 즉시 실험실로 운반하고, 원정액을 Tris-Egg yolk extender과 1:1로 희석하여 냉각을 시작하여 5단계를 거쳐 총 2시간 동안 냉각시켰다.
정자의 생존성은 eosin-Y 염색법을 이용하여 생존율을 평가하였다. 0.
첨체막의 변화 양상을 측정하기 위하여 chlortetracyclin(CTC) 염색법을 사용하였으며, 이 방법으로 정자의 첨체막 변화 양상을 조사하였다. 정액을 400 ×g에서 2분간 원심분리하여 세척한 다음 500 μl의 CTC 용액(750 μM CTC, 130 mM NaCl, 5 mM cysteine, 20 mM Tris buffer; pH 7.
성능/효과
4%의 LDL과 5%의 난황을 처리한 실험구에서 8% LDL을 첨가한 실험구보다 glycerol과 ethylene glycol 모두 유의적으로 높은 운동성과 생존율을 보였다 (p<0.05).
B pattern의 비율에 있어 ethylene glycol 기반의 4% LDL과 5% 난황 그리고 8% LDL을 첨가한 실험구에서 10% 난황 처리구보다 유의적으로 높은 B pattern 비율을 나타냈다(p<0.05).
Glycerol을 동결보호제로 사용한 경우 (B), ethylene glycol과 마찬가지로 10% 난황만을 첨가한 실험구에서 30분, 1시간, 2시간, 5시간 그리고 12시간에 모두 LDL을 첨가한 실험구에 비하여 유의적으로 감소하였음을 나타냈다 (p<0.05).
05). 그러나 10%의 난황을 처리한 실험구와의 비교에서는 다소 높은 운동성과 생존율을 나타냈으나, 유의적인 차는 보이지 않았다.
그러나 glycerol 실험구에서는 (B) 5시간에서 10% 난황만을 처리한 실험구가 다른 실험구에 비하여 정자의 꼬리 팽창 비율이 유의적으로 감소되는 결과를 보였다 (p<0.05).
그러나 정자막 온전성에 있어서 ethylene glycol 기반에서는 LDL과 난황과의 유의적 차이는 볼 수 없었으나, LDL 첨가시 다소 높은 정자막 온전성의 비율을 나타냈으며, glycerol 기반에서는 난황만을 첨가하였을 때 5시간째에 온전한 정자막을 가진 정자의 비율이 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
그러나 첨체 반응이 일어난 AR pattern의 비율에 있어서는 4%의 LDL과 5%의 난황을 처리한 실험구에서 낮은 수준의 AR pattern의 비율을 나타냈으나, 오직 4%의 LDL과 5%의 난황을 처리한 ethylene glycol 실험구에서만 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05).
그러나 첨체반응이 완료된 AR pattern의 비율은 ethylene glycol 기반에서 4%의 LDL과 5%의 난황을 처리한 실험구에서만 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다(p<0.05).
동결 융해 후 시간에 따라 저장액에서 정자의 꼬리 팽창 비율의 감소를 나타낸 결과 (Fig. 3), ethylene glycol을 동결보호제로 사용한 실험구에서는 난황과 LDL 모두 유의적 차이를 나타내지 않았다. 그러나 glycerol 실험구에서는 (B) 5시간에서 10% 난황만을 처리한 실험구가 다른 실험구에 비하여 정자의 꼬리 팽창 비율이 유의적으로 감소되는 결과를 보였다 (p<0.
동결 융해 후 시간이 경과함에 있어 1시간과 2시간에서 ethylene glycol의 10% 난황 첨가구에서 유의적인 생존율의 감소를 보였으며(p<0.05), glycerol 기반에서는 30분, 1시간, 2시간, 5시간 그리고 12시간까지 10% 난황의 처리구에서 유의적인 생존율의 감소를 나타냈다(p<0.05).
05). 또한 비록 유의적 차이는 볼 수 없었지만, 10%의 난황만을 사용한 실험구에 비하여도 정자의 운동성과 생존율이 높은 경향을 보였다. 일반적으로 난황은 소의 정액을 동결 보존하는데 있어 널리 사용되고 있다.
또한 조기 첨체반응에 있어 AR pattern 비율은 ethylene glycol 기반의 4% LDL과 5% 난황을 첨가한 실험구에서 타 실험구에 비하여 유의적으로 낮은 비율의 결과를 보였다(p<0.05).
본 실험의 결과, 5%의 ethylene glycol을 동결보호제로 하여 4% LDL과 5%의 난황을 처리한 실험구에서 정자의 꼬리 팽창 비율이 유의적으로 가장 높게 나타났으며(p<0.05), 8%의 LDL을 처리한 실험구에서는 ethylene glycol과 glycerol 모두 유의적으로 낮은 꼬리 팽창율의 결과를 나타냈다(p<0.05).
본 연구에서 37℃에서 시간에 따라 정자의 생존율의 감소 비율을 검사한 결과, ethylene glycol과 glycerol 기반 모두에서 LDL의 첨가가 정자의 수정 가능한 최소 시간까지 정자의 생존율 감소를 유의적으로 막아주는 것으로 나타났다(p<0.05).
본 연구에서 4%의 LDL과 5%의 난황을 첨가하여 동결하였을 때 8%의 LDL만을 사용한 경우보다 정자의 운동성 및 생존율이 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05).
그러나, 동결 과정동안 정자를 보호하는데 있어 LDL이 제공하는 도움에 대한 정확한 기작은 분명하지 않다. 본 연구에서 HOST를 통하여 정자막의 온전성을 검사하였으며, HOST는 사람에 있어 정자 막의 기능적 온전성을 검사하는데 널리 쓰이고 있다. 정자 막에 손상이 입었을 때 저장액에서 정자의 꼬리가 부풀거나 말리지 않기 때문에 정자막의 기능성을 검사할 수 있다(Mordel 등, 1993).
본 연구에서 LDL을 첨가하여 동결 융해하였을 때 4% LDL과 5%의 난황을 첨가한 ethylene glycol 기반의 희석제를 사용하였을 때 유의적으로 높은 정자 미부 팽창율을 보였다(p<0.05).
본 연구의 결과 LDL이 첨가된 모든 실험구에서 수정능력과 직접적인 관련이 있는 B pattern이 비율이 높게 나타났으며, 특히 ethylene glycol 기반에서 LDL은 유의적으로 B pattern의 비율을 증가시킨 것으로 나타났다(p<0.05).
수정능력획득이 일어난 B pattern의 비율은 LDL을 처리한 실험구에서 난황만을 사용한 실험구보다 높은 비율을 나타냈으며, 4% LDL과 5%의 난황을 처리한 ethylene glycol과 8%의 LDL을 처리한 ethylene glycol 실험구에서 유의적으로 높은 수준의 수정능 획득 비율을 나타냈다 (p<0.05).
수정능획득이 일어나지 않은 F pattern의 비율은 10%의 난황을 처리한 glycerol에서 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), 8%의 LDL을 처리한 ethylene glycol에서 유의적으로 낮은 비율의 F pattern을 나타냈다(p<0.05).
정자막 온전성 검사에서는 ethylene glycol 기반의 4% LDL과 5% 난황을 첨가한 실험구에서 64.65% ± 6.10으로 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높은 비율을 나타냈다.
정자의 생존율은 ethylene glycol 기반의 4% LDL과 5% 난황을 첨가한 실험구에서 66.85% ± 5.06으로 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높았으나, 같은 ethylene glycol 기반의 10% 난황 처리구와는 유의적 차이가 없었다.
제주흑우의 정액을 동결 융해한 결과, ethylene glycol과 glycerol 기반의 4% LDL과 5% 난황을 첨가한 실험구에서 69.00% ± 4.18과 63.00% ± 9.75로 8% LDL 처리구보다 유의적으로 높았으나(p<0.05), 10% 난황 처리구와는 유의적 차이가 나타나지 않았다.
후속연구
이러한 결과는 LDL이 동결과정에서 발생하는 손상으로 부터 정자를 성공적으로 보호하고 있음을 시사하며, 희소 한우 품종인 제주흑우의 안정적인 정액 동결방법을 확립하는데 있어 효과적인 자료를 제시할 것으로 사료된다.
이러한 결과는 희소 가축의 생식세포 보존 및 유전자원 확립을 위한 중요한 자료가 될 것이며, 제주흑우 및 희소 가축의 안정적이고 효율적인 동결 정액 제조 연구에 있어 중요한 정보를 제공할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
제주흑우의 산업적 활발한 유통이 어려운 이유는 무엇인가?
제주흑우는 유엔식량농업기구(Food and Agriculture Organization: FAO)에 등록되어 있는 한우 중 하나로 칡소 등과 함께 멸실위험에 처한 희소한우로 분류되어 있다. 제주흑우는 희소 품종으로 분류되어 있기에 현재 산업적 이용에 있어 활발한 유통은 어렵지만, 국내 가축유전자원의 다양성 확보에 있어 매우 중요한 국가적 자원이다. 따라서, 국내 가축유전자원의 다양성 확보 및 국가 중요 유전자원으로서의 안정적인 보존이 필요하다.
제주흑우란 무엇인가?
제주흑우는 유엔식량농업기구(Food and Agriculture Organization: FAO)에 등록되어 있는 한우 중 하나로 칡소 등과 함께 멸실위험에 처한 희소한우로 분류되어 있다. 제주흑우는 희소 품종으로 분류되어 있기에 현재 산업적 이용에 있어 활발한 유통은 어렵지만, 국내 가축유전자원의 다양성 확보에 있어 매우 중요한 국가적 자원이다. 따라서, 국내 가축유전자원의 다양성 확보 및 국가 중요 유전자원으로서의 안정적인 보존이 필요하다.
포유동물의 정자를 동결하는데 있어 지난 60년간 난황이 널리 이용된 이유는 무엇인가?
일반적으로, 달걀의 난황은 정자의 동결 시 저온 충격으로부터 정자를 보호하고 액체질소(Phillips와 Lardy, 1940; Dunn 등, 1950; Shannon 등, 1983; Barak 등, 1992) 또는 냉각된 상태(Lasley와 Mayer, 1944; Foot과 Bartton, 1949; Watson, 1976; De Leeuw 등, 1993)로부터 정자의 수정능력을 유지시켜 주는데 큰 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 다양한 포유동물의 정자를 동결하는데 있어 지난 60년간 난황이 널리 이용되어 왔다.
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