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문제 정의
- 본 연구에서는 공침법을 이용하여 BCP 분말을 합성 하고, 합성된 분말의 결정학적 특성 및 화학적 결합 거동을 측정하기 위하여 XRD 및 FT-IR을 통하여 X-선회절 분석 및 적외선 분광분석을 실시하였다. 또한 생체 활성 거동을 평가하기 위하여 Hanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)에 침적시켜 시간에 따른 BCP 분말의 형상, 결정성 및 HBSS 용액의 이온농도 변화를 분석하였다.
제안 방법
- BCP 분말의 생체활성 거동을 평가하기 위해 제조한 분말을 Hanks’ Balanced Salt Solution(HBSS; SigmaAldrich, Japan)에서 1주, 2주, 3주간 36.5°C의 인큐베이터에서 침적 테스트하였으며, 일정한 이온 농도를 유지하기 위하여 HBSS를 2일마다 교환해주었다.
- 7은 BCP 분말의 MTT assay 결과이다. DMEM 배지에 BCP 분말을 첨가하지 않은 샘플을 대조군으로 설정하여 BCP 분말을 첨가한 샘플과의 MG-63 세포의 성장률을 비교하여 나타내었다. 대조군의 1주 후 세포 성장률을 100 % 기준으로 하여 나타낸 그래프에서 초기 1주 후 세포 성장률이 BCP 분말의 경우 감소하는 경향을 보이나 이는 생물학적으로 세포의 괴사가 일어나는 수준은 아닌 것으로 판단되어지며, 시간이 증가할수록 대조군에 비해 세포의 성장률이 증가하는 경향을 나타내어 생물학적으로 BCP 분말의 적용에 문제가 없음을 나타내 주는 결과로 사료되어진다.
- HAp/β-TCP의 부피 분율이 60 : 40인 BCP 분말을 합성하기 위하여 출발물질의 Ca/P 몰 비율을 1.602로 고정하여 공침물을 제조하였다.
- HBSS 침적 후의 표면의 형상 변화 및 표면의 결정상 변화를 XRD 및 SEM을 통하여 관찰하였다. HBSS 침적 기간에 따른 HBSS 용액의 Ca, P 이온 농도의 변화를 ICPAES(ICPS-7500, Shimadzu, Japan)를 통해 측정하였다. BCP 분말의 세포 독성을 평가하기 위하여 Human osteosarcoma cell line인 MG-63을 이용하여 MTT assay 를 실시하였다.
- 5°C의 인큐베이터에서 침적 테스트하였으며, 일정한 이온 농도를 유지하기 위하여 HBSS를 2일마다 교환해주었다. HBSS 침적 후의 표면의 형상 변화 및 표면의 결정상 변화를 XRD 및 SEM을 통하여 관찰하였다. HBSS 침적 기간에 따른 HBSS 용액의 Ca, P 이온 농도의 변화를 ICPAES(ICPS-7500, Shimadzu, Japan)를 통해 측정하였다.
- MTT assay는 cell을 penicillin(100 units/ ml), streptomycin(100 μg/ml) solution과 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, USA)이 포함된 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM, Gibco, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37°C 배양기에서 배양시켜 사용하였다.
- 또한 생체 활성 거동을 평가하기 위하여 Hanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)에 침적시켜 시간에 따른 BCP 분말의 형상, 결정성 및 HBSS 용액의 이온농도 변화를 분석하였다.
- 반응생성물의 여과 및 미 반응물을 제거하기 위해 증류수로 수회 반복 적으로 수세하고, 여분의 수분을 제거하기 위하여 80°C 로 고정된 건조기에서 24시간 건조하였다.
- 본 연구에서는 HAp/β-TCP의 비율이 60 : 40인 분말을 공침법을 이용하여 합성하였다.
- 열처리에 따른 탈수 축합 거동을 분석하기 위하여 400~4000 cm-1 범위에서 FT-IR(Nicolet Magna IR 560, USA)측정하였다. 열처리 전후의 분말의 형상 변화를 관찰하기 위하여 Osmium 코팅 후 SEM(HITACHI S-4800, Japan)을 이용하여 분석하였다.
- 5 Slit계, 측정 범위는 25°~45°(2θ)이었다. 열처리에 따른 탈수 축합 거동을 분석하기 위하여 400~4000 cm-1 범위에서 FT-IR(Nicolet Magna IR 560, USA)측정하였다. 열처리 전후의 분말의 형상 변화를 관찰하기 위하여 Osmium 코팅 후 SEM(HITACHI S-4800, Japan)을 이용하여 분석하였다.
- 우선 24 well에 MG-63 1 × 104 개를 분주하고, 24시간 뒤에 새 배지로 교체 후 시료를 1 mg/ml로 처리하였다.
- 제조된 BCP 분말의 열처리 전 후의 결정상 변화를 관찰하기 위해 X-선 회절분석장치(XRD, D/max-IIA, Rigaku, Japan)를 이용하여 분석하였다. 측정조건은 CuKα, 30 kV, 25 mA, scanning speed 1°/min, 0.
- pH 11로 조절된 (NH4)2HPO4 수용액을 교반시키면서 Ca(NO3)2 ·4H2O을 천천히 첨가하였다. 제조된 수용액을 2시간 동안 교반한 후 상온에서 24시간 동안 시효처리(Aging)하였다. 반응생성물의 여과 및 미 반응물을 제거하기 위해 증류수로 수회 반복 적으로 수세하고, 여분의 수분을 제거하기 위하여 80°C 로 고정된 건조기에서 24시간 건조하였다.
대상 데이터
- BCP(HAp : β-TCP = 60 : 40) 분말을 합성하기 위하여 Ca/P 몰 비율을 1.602로 조절하여 공침분말을 제조하였다.
- 공침물은 출발물 질인 Ca(NO3)2·4H2O와 (NH4)2HPO4를 증류수에 용해하여 각각을 수용액 상태로 제조하였다.
이론/모형
- 또한 생체 활성 거동을 평가하기 위하여 Hanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)에 침적시켜 시간에 따른 BCP 분말의 형상, 결정성 및 HBSS 용액의 이온농도 변화를 분석하였다. BCP 분말의 세포 독성 평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다.
- HBSS 침적 기간에 따른 HBSS 용액의 Ca, P 이온 농도의 변화를 ICPAES(ICPS-7500, Shimadzu, Japan)를 통해 측정하였다. BCP 분말의 세포 독성을 평가하기 위하여 Human osteosarcoma cell line인 MG-63을 이용하여 MTT assay 를 실시하였다. MTT assay는 cell을 penicillin(100 units/ ml), streptomycin(100 μg/ml) solution과 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, USA)이 포함된 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM, Gibco, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37°C 배양기에서 배양시켜 사용하였다.
- 본 연구에서 biphasic calcium phosphate(BCP) 분말을 제조하기 위하여 출발물질로 Ca(NO3)2·4H2O(Junsei chemical, Japan), (NH4)2HPO4(Junsei chemical, Japan)를 사용하였고, 제조공정으로 공침법(co-precipitation process) 을 이용하였다.
- 생성된 BCP 분말의 생체활성 거동을 평가하기 위해 Hanks’ Balanced Salt Solution(HBSS)에 침적 후 시간에 따른 표면의 형상 변화를 관찰한 결과를 Fig. 4에 나타내었다.
성능/효과
- 침적 3주 후 BCP 표면(Fig. 4(c))에 낮은 결정화도의 HAp로 보이는 휘스커 타입의 입자가 형성됨을 관찰하였고, EDS 결과 Ca와 P 원소가 검출되었다. HBSS 침적 후 생성되는 입자의 존재를 확인하기 위하여 침적 후 HBSS 용액의 농도를 ICP-AES 측정한 결과(Fig.
- 4(c))에 낮은 결정화도의 HAp로 보이는 휘스커 타입의 입자가 형성됨을 관찰하였고, EDS 결과 Ca와 P 원소가 검출되었다. HBSS 침적 후 생성되는 입자의 존재를 확인하기 위하여 침적 후 HBSS 용액의 농도를 ICP-AES 측정한 결과(Fig. 5), 초기의 농도를 기준점으로 하여 Ca2+와 #의 이온농도가 시간에 따라 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 HBSS 용액 내의 Ca2+와 # 이온이 BCP 분말의 표면에 낮은 결정화도의 HAp를 생성시킨 결과로 사료되어 진다.
- DMEM 배지에 BCP 분말을 첨가하지 않은 샘플을 대조군으로 설정하여 BCP 분말을 첨가한 샘플과의 MG-63 세포의 성장률을 비교하여 나타내었다. 대조군의 1주 후 세포 성장률을 100 % 기준으로 하여 나타낸 그래프에서 초기 1주 후 세포 성장률이 BCP 분말의 경우 감소하는 경향을 보이나 이는 생물학적으로 세포의 괴사가 일어나는 수준은 아닌 것으로 판단되어지며, 시간이 증가할수록 대조군에 비해 세포의 성장률이 증가하는 경향을 나타내어 생물학적으로 BCP 분말의 적용에 문제가 없음을 나타내 주는 결과로 사료되어진다.
- 이는 β-TCP의 빠른 분해에 의해서 이온의 농도가 증가하여 생성되는 낮은 결정화도의 HAp가 시간에 따라 증가한 것으로 판단할 수 있는 반응의 속도론적인 결론은 도출할 수 없으나 BCP 분말이 유사체액 내에서의 생체활성 거동이 증가하는 사실은 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과로 BCP 조직이 유사체액 내에서의 생체 활성을 가지는 것으로 판단할 수 있으며, 세포독성 평가에서도 대조군과 비교하여 생물학적 특성이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
- 측정된 X-선 회절패턴 결과를 토대로 적분강도 값을 식 (1)에 대입하여 부피분율을 계산한 결과 본 연구에서 얻고자 하는 HAp/β-TCP = 60 : 40의 BCP 분말을 얻을 수 있었다.
- 합성된 분말의 열처리 전 후의 X-선 회절 패턴과 FT-IR의 분광학적 특성을 관찰한 결과 Ca/P 비율이 1.602로 조절하여 HAp와 β-TCP상이 혼재된 BCP 조직을 확인하였다, 생체활성 거동을 평가하고자 HBSS에 침적 후 표면의 형상 변화를 관찰한 결과, 침적 3주 후 낮은 결정화도의 HAp의 존재를 확인하였다.
후속연구
- 침적 시간에 따른 이온 농도의 변화에 Ca2+와 # 이온의 농도의 감소와 침적 후 시간에 따른 BCP 분말의 X-선 회절 패턴에서도 HAp 및 β-TCP의 결정성이 감소하는 경향은 이를 뒷받침 하는 결과로 판단되어진다. 또한 세포독성 평가에서도 대조군에 비하여 세포의 성장률이 증가함으로써 BCP 분말이 생체 내에서 적용될 경우 생체활성을 증가시킬 수 있을 것으로 판단되어진다.
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