식물생장과 발달에 중요한 역할을 하는 phytochrome이 ethylene 생합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 여러 빛 조건에서 키운 phyA, phyB, phyAB에서 ethylene 생합성과 생합성에 관여하는 enzyme activity를 측정하였다. White light에서 키웠을 때 모든 mutant에서 ethylene 생합성이 감소되었다. 특히 double mutant에서는 wild type과 비교하여 37%가 감소하였다. Dark에서 키웠을 때에는 wild type만 감소하였고, mutant에서는 감소효과가 나타나지 않았다. Red light에서 키웠을 때 double mutant에서 급격한 감소가 일어났다. Far-red light 에서 키웠을 때는 phyB만 감소가 일어나지 않았다. Ethylene 생합성에 관여하는 enzyme인 ACO 활성 패턴과는 달리ACS 활성 패턴은 ethylene 생성 패턴과 유사하게 나타났다. 이 결과를 바탕으로 ethylene 생합성에는 phytochrome A와 B 모두 중요한 작용을 하며 특히 $P_r$ 형태의 phytochrome이 ethylene 생성량을 조절한다는 것을 제시한다. 또한 phytochrome은 ethylene 생합성 단계에서 AdoMet가 ACC로 전환되는 단계에서 조절하는 것을 제시한다.
식물생장과 발달에 중요한 역할을 하는 phytochrome이 ethylene 생합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 여러 빛 조건에서 키운 phyA, phyB, phyAB에서 ethylene 생합성과 생합성에 관여하는 enzyme activity를 측정하였다. White light에서 키웠을 때 모든 mutant에서 ethylene 생합성이 감소되었다. 특히 double mutant에서는 wild type과 비교하여 37%가 감소하였다. Dark에서 키웠을 때에는 wild type만 감소하였고, mutant에서는 감소효과가 나타나지 않았다. Red light에서 키웠을 때 double mutant에서 급격한 감소가 일어났다. Far-red light 에서 키웠을 때는 phyB만 감소가 일어나지 않았다. Ethylene 생합성에 관여하는 enzyme인 ACO 활성 패턴과는 달리ACS 활성 패턴은 ethylene 생성 패턴과 유사하게 나타났다. 이 결과를 바탕으로 ethylene 생합성에는 phytochrome A와 B 모두 중요한 작용을 하며 특히 $P_r$ 형태의 phytochrome이 ethylene 생성량을 조절한다는 것을 제시한다. 또한 phytochrome은 ethylene 생합성 단계에서 AdoMet가 ACC로 전환되는 단계에서 조절하는 것을 제시한다.
In order to investigate the effect of phytochromes on the regulation of ethylene biosynthesis, we measured the ethylene production and the activities of enzymes involved in ethylene biosynthesis using phytochrome mutants such as $phyA$, $phyB$, and $phyAB$ of Arabido...
In order to investigate the effect of phytochromes on the regulation of ethylene biosynthesis, we measured the ethylene production and the activities of enzymes involved in ethylene biosynthesis using phytochrome mutants such as $phyA$, $phyB$, and $phyAB$ of Arabidopsis. The ethylene production was decreased in mutants grown in white light. In particular, double mutants showed a 37% decrease compared to the wild type in ethylene production. When Arabidopsis roots were grown in the dark, mutants did not show a decrease in ethylene production; however, production was significantly decreased in the double mutant grown in red light. Only $phyB$ did not show the decrease in the ethylene production in far-red light. Unlike the ACO activities, the ACS activities of mutants showed the same pattern as the ethylene production under several light conditions. The results of ACS activities confirmed the expression of the ACS gene by RT-PCR analysis. The decrease of ethylene production in mutants was due to the lower activity of ACC synthase, which converts the S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), the precursor of ethylene. These results suggested that both phytochrome A and B play an important role in the regulation of ethylene biosynthesis in Arabidopsis roots in the conversion step of AdoMet to ACC, which is regulated by ACS.
In order to investigate the effect of phytochromes on the regulation of ethylene biosynthesis, we measured the ethylene production and the activities of enzymes involved in ethylene biosynthesis using phytochrome mutants such as $phyA$, $phyB$, and $phyAB$ of Arabidopsis. The ethylene production was decreased in mutants grown in white light. In particular, double mutants showed a 37% decrease compared to the wild type in ethylene production. When Arabidopsis roots were grown in the dark, mutants did not show a decrease in ethylene production; however, production was significantly decreased in the double mutant grown in red light. Only $phyB$ did not show the decrease in the ethylene production in far-red light. Unlike the ACO activities, the ACS activities of mutants showed the same pattern as the ethylene production under several light conditions. The results of ACS activities confirmed the expression of the ACS gene by RT-PCR analysis. The decrease of ethylene production in mutants was due to the lower activity of ACC synthase, which converts the S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), the precursor of ethylene. These results suggested that both phytochrome A and B play an important role in the regulation of ethylene biosynthesis in Arabidopsis roots in the conversion step of AdoMet to ACC, which is regulated by ACS.
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문제 정의
ACS와 ACO는 모든 식물에서 다유전자족family에 의해 암호화되며[2], Arabidopsis 유전체는 12개의 ACS 유전자와[26], 5개의 ACO 유전자들을 암호화 한다. 따라서 본 실험에서는 ACS12와 ACO2 유전자의 발현을 비교하였다.
본 연구에서는 다양한 빛 조건에서 Arabidopsis phyto-chrome mutant의 뿌리에서 ethylene 생합성과 생합성에 관여하는 enzyme활성을 측정하여 phytochrome과 ethylene 작용과의 관계를 밝히고자 하였다.
제안 방법
2 ml에 5 mM AdoMet 20 μl를 첨가한 다음, 실리콘 마개로 막고 1시간 동안 진탕 배양(dark, 22℃, 170 rpm) 하였다. 20 mM HgCl2 용액과 냉각된 NaOH / NaOCl (포화된 NaOH : 5% NaOCl = 1 : 1 [v/v]) 용액으로 에틸렌 생성을 유도한 뒤 GC를 이용하여 ACS활성을 측정하였다.
5 mM chloramphenicol)이 들어있는 vial에 넣고 실리콘 마개로 막은 후, 8시간 동안 진탕 배양(dark, 27℃, 170 rpm) 하였다. 2시간 간격으로 기체 1 ml을 채취한 후 Gas chromatography (Hewlett-Packard, HP5890 series Ⅱ; 80/100 Porapak-Q column, oven temp: 120℃, injector temp: 150℃, detector temp: 280℃)를 이용하여 에틸렌 생성량을 측정하였다.
PCR을 위해 EmeraldAmpTM PCR Master Mix (Premix, TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 모든 조건과 방법은 manual 에 따라 실험을 하였다. PCR product는 1.8% agarose gel 상에서 분리하고 ethidium bromide (EtBr) 용액으로 염색한 후 gel image analysis system (CoreBio, i-MAX-D500, Korea)을 이용하여 촬영하였다.
그 후 70% ethanol로 세척하고 건조시켜 0.1% [v/v] DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)-DW 20 μl에 녹여 total RNA를 획득 하였다.
녹색 광이 켜 있는 암실에서 수거한 뿌리 절편 200개를 ex traction buffer (100 mM MES buffer, pH 7.5, 10% [v/v] glycerol, 30 mM Sodium ascorbate, 2 mM DTT)에서 분쇄하여 원심분리(4℃, 15,000 rpm) 한 후, 상등액에 incubation buffer (50 mM MES buffer, pH 7.5, 10% [v/v] glycerol, 30 mM Sodium ascorbate, 2 mM DTT, 30 mM NaHCO3, 50 μM FeSO4, 1 mM ACC)를 첨가하여 GC를 이용하여 측정하였다.
녹색광이 켜 있는 암실에서 수거한 뿌리 절편 200개를 액체질소와 함께 분쇄한 후, RNA extraction buffer (100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 100 mM NaCl, 1% [w/v] SDS, 0.2% [v/v]2-mercaptoethanol)를 첨가한다. 그리고 동일부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1 [v/v])를 첨가하여 잘 섞어준 후 50℃에서 10분 동안 반응시켰다.
식물 생장과 발달에 중요한 역할을 하는 phytochrome이 ethylene 생합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 여러 빛 조건에서 키운 phyA, phyB, phyAB와 같은 phytochrome mutants에서 ethylene 생합성을 측정하였다.
여러 빛 조건에서 키운 각 phytochrome mutant의 ethylene 생합성의 감소 작용이 ethylene 생합성 과정 중 어느 단계가 조절되어 일어나는지 확인하기 위하여 AdoMet가 ACC로 전환되는 과정을 촉진하는 효소인 ACS와 ACC가 ethylene으로 전환되는 단계를 조절하는 ACO의 활성을 여러 빛 조건에서 키운 각 mutant와 WT에서 측정하였다.
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)의 Landsberg erecta (Ler)생태형 유식물과 phyA-201, phyB-1, phyA-201phyB-5 돌연변이체 유식물[8]을 실험 재료로 사용하였다. 종자는 70%와 95% ethanol에서 각각 5분 동안 표면 살균을 한 후, 생장배지(1/2 MS salts, 1 mM MES buffer, pH 5.8, 1% [w/v] sucrose, 1%[w/v] agar)가 든 Petri dish (87x15 mm)에 일렬로 심었다. 4℃에서 하루 동안 저온 처리 한 후, Petri dish를 수직으로 세워 22℃, white light (50 μmol m-2․s-1) 아래에서 2일 동안발아시켰다.
추출한 total RNA를 주형으로 cDNA를 얻기 위해 역전사 (RT, reverse transcription) AccuPowerTM RT PreMix (Bioneer, USA and Korea)를 사용하였고, 합성된 first-strand cDNA를 주형으로 하여 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer set는 Table 1과 같다.
대상 데이터
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)의 Landsberg erecta (Ler)생태형 유식물과 phyA-201, phyB-1, phyA-201phyB-5 돌연변이체 유식물[8]을 실험 재료로 사용하였다. 종자는 70%와 95% ethanol에서 각각 5분 동안 표면 살균을 한 후, 생장배지(1/2 MS salts, 1 mM MES buffer, pH 5.
0 cm 로 자란 뿌리를 실험에 사용하였다. 광원은 Led Plant Radiation System (LPRS, GFPM-1600, Good Feeling, Korea)을 사용하였다.
그리고 white light (50 μmol m-2․s-1), red light (650~680 nm; 24 μmol m-2․s-1), far-red light (710~740 nm;1.3 μmol m-2․s-1), dark 등 여러 빛 조건에서 5～6일 동안 키워 1.5～2.0 cm 로 자란 뿌리를 실험에 사용하였다.
1% [v/v] DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)-DW 20 μl에 녹여 total RNA를 획득 하였다. 추출한 total RNA는 Microplate Reader infiniteⓇ200(TECAN, USA)를 이용하여 정량하였다.
데이터처리
데이터의 통계적 분석을 위해 Sigma Plot software (v8.0, SPSS)를 이용하였다. 모든 결과는 평균±표준오차(SE)로 표시하였고, p＜0.
모든 결과는 평균±표준오차(SE)로 표시하였고, p＜0.05 유의성 검정을 위해 two-way ANOVA test와 Duncan method를 사용하였다.
이론/모형
PCR에 사용된 primer set는 Table 1과 같다. PCR을 위해 EmeraldAmpTM PCR Master Mix (Premix, TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 모든 조건과 방법은 manual 에 따라 실험을 하였다. PCR product는 1.
성능/효과
8시간 배양 후 in vitro에서 ACO활성을 측정한 결과, 여러빛 조건에서 키웠을 때 모두 WT와 mutant사이에 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 3). 특히 dark에서 키운 경우 phyA 와 phyB가 WT보다 높은 ACO 활성을 나타내었고, phyAB는 WT와 거의 같은 수준의 활성을 보였다.
Dark에서 키웠을 때, 각 mutant의 ACS 활성은 ethylene 생합성과 같이 WT와 비교하여 거의 감소하지 않은 반면, Red light에서 키웠을 때, WT와 비교하여 phyA는 32.5%, phyB는 35% phyAB는 45% ACS 활성이 감소되었다(Fig. 2). Far red light에서 키웠을 때도 ACS 활성은 Red light에서 키웠을 때와 유사한 감소 패턴을 나타냈다.
1). Dark에서 키웠을 때를 제외하고 모든 빛 조건에서 단일 mutant보다 double mutant에서 ethylene 생합성이 크게 감소하였다. 이 결과는 ethylene 생합성에는 phytochrome A와 B 모두 중요한 작용을 한다는 것을 제시한다.
Fig. 4에서 Arabidopsis의 phytochrome mutant와 WT의뿌리에서 ACS2와 ACO2 유전자의 발현을 RT-PCR 증폭을 통해 확인한 결과, White light에서 키웠을 때, WT, phyA, phyB, phyAB의 순서로 ACS12 발현이 낮게 나타났고, ACO2는 발현의 차이가 나타나지 않았다. Dark에서 키운 경우 phyAB의 ACS2 발현이 WT와 다른 돌연변이체들에 비해 낮은 발현을 나타냈다.
White light에서 키웠을 때 8시간 배양 후 ACS 활성을 측정한 결과, 각 mutant는 WT와 비교하여 활성이 감소하였다(Fig. 2). Double mutant의 경우 WT과 비교하여 약 55% 활성이 감소하였다.
그러므로 이 결과는 Arabidopsis에서 ethylene 생합성 조절은 ACO보다는 ACS 유전자의 전사 수준이 감소되어 에틸렌 생합성 과정이 조절됨을 제시한다.
일반적으로 뿌리와 하배축 혹은 줄기에서 ethylene 생성은 정반대로 나타나는 경향이 있으며, ethylene이 영향을 주는 생리 반응도 조직에 따라 다르게 나타난다[1]. 따라서 식물의 기관이나 종류에 따라 어느 정도 차이는 있지만 phytochrome이 ethylene 생성에 영향을 미치며, 본 연구 결과에 따르면 Arabidopsis 뿌리에서 phytochrome이 ethylene 생성을 조절하여 생리 반응에 관여할 가능성을 제시하고 있다.
한편 Arabidopsis 유식물에서 낮은 강도의 빛과 비교하여 높은 강도의 빛에서 ethylene 생합성이 증가하였고, 같은 조건에서 phyB-9는 wild type (Col-0)에 비해 ethylene 생성이 더 증가하였다[25]. 또한 완두(Pisum sativum)줄기에서 double mutant인 phyA phyB는 야생형보다 에틸렌 생성량이 증가하였고, internode의 길이도 짧고 비대해졌다. 특히 phytochrome A는 ethylene 생성을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 제시하였다[5].
그러나 far-red light에서 phytochrome 은 주로 Pr 형태로 존재하며 far-red light에서 키웠을 때 phyA가 phyB에 비해 ethylene 생성이 약 30% 감소하였다. 이 결과는 Pr 형태의 phytochrome이 ethylene 생성량을 주로 조절한다는 것을 제시한다.
특히 dark에서 키운 경우 phyA 와 phyB가 WT보다 높은 ACO 활성을 나타내었고, phyAB는 WT와 거의 같은 수준의 활성을 보였다. 이 결과를 통하여 phytochrome은 ethylene 생합성 과정에서 AdoMet가 ACC로 전환되는 단계를 조절하여 ethylene 생합성을 조절한다는 것을 제시하고 있다.
또한 담배에서 phytochrome이 관여하는 음지회피 반응에 ethylene과 gibberellin이 작용한다고 발표하였다[17]. 이러한 결과들과 본 실험의 결과를 종합적으로 판단할 때 phytochrome이 관여하는 식물생리 반응은 ethylene과 같은 식물호르몬을 통하여 조절할 가능성을 제시하고 있다.
3). 특히 dark에서 키운 경우 phyA 와 phyB가 WT보다 높은 ACO 활성을 나타내었고, phyAB는 WT와 거의 같은 수준의 활성을 보였다. 이 결과를 통하여 phytochrome은 ethylene 생합성 과정에서 AdoMet가 ACC로 전환되는 단계를 조절하여 ethylene 생합성을 조절한다는 것을 제시하고 있다.
후속연구
이들이 제시한 모델에 따르면 벼에서 OsEREBP1-like gene인 EBL1 이 phytochome B의 작용을 중계하여 ACO1 upregulation에 관여한다. 그러나 본 연구 결과에서는 phytochrome이 ACS를 조절하여 ethylene 생성을 조절할 가능성을 제시하고 있다. 이러한 차이는 단자엽인 벼의 줄기와 쌍자엽인 Arabidopsis뿌리와 같이 식물 종과 기관의 차이에 따른 것으로 판단된다.
이러한 차이는 단자엽인 벼의 줄기와 쌍자엽인 Arabidopsis뿌리와 같이 식물 종과 기관의 차이에 따른 것으로 판단된다. 그러므로 Arabidopsis의 뿌리에서 분자생물학적 수준의 연구가 앞으로 더 진행될 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식물에서 Ethylene 이란?
Ethylene은 가스 형태의 식물호르몬으로 식물 생장과 발달에 관여한다. 특히 열매나 꽃의 노화 및 성숙, 그리고 줄기나 뿌리의 신장을 억제하고 부피생장을 촉진한다[21].
Ethylene이 식물의 열매, 꽃, 줄기, 뿌리에 미치는 영향은?
Ethylene은 가스 형태의 식물호르몬으로 식물 생장과 발달에 관여한다. 특히 열매나 꽃의 노화 및 성숙, 그리고 줄기나 뿌리의 신장을 억제하고 부피생장을 촉진한다[21]. Methionine은 S-adenosyl-L-methionine (AdoMet)으로 전환되고, AdoMet은 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) synthase(ACS)에 의해 ACC로 전환되고, ACC는 ACC oxidase (ACO)에 의해 ethylene으로 전환된다[1].
phytochrome이란?
Arabidopsis에서 빛에 의한 식물 생장 조절을 담당하는 phytochrome은 넓은 범위의 빛에 반응하는 중요한 광 수용체이다. Arabidopsis는 5종류의 phytochrome gene family(PHYA ~ PHYE)를 가지고 있는데, 이들은 아미노산 서열의 유사성에 기초하여 phyA/C와 phyB/D/E인 2가지 유형으로 분류할 수 있다[4].
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