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문제 정의
- , 2010). 이에 본 연구에서는 청정자원인 해양심층수에 다양한 미네랄이 함유되어 있는 사해수에서 채취한 사해염을 첨가하여 마스크 팩을 제작하고, 이를 창상에 적용하여 피부재생에 미치는 효과를 알아보았다.
제안 방법
- 20마리의 백서의 등에 지름 1 cm 크기의 원형의 전층피부결손을 3곳에 만든 후 적용할 팩의 종류를 무작위로 할당하여 창상 치유에 미치는 창상의 위치에 대한 변수를 제거하였다. 실험 동물은 술후 3, 7, 10, 14일째 각 5마리를 희생하여 피부조직을 채취하였다.
- 2. Photographs of wound spot at days 2, 4, 7, 9, 11 and 14, taken postoperatively after full-thickness skin excision (scale bar: 5 mm). The size of the wound was decreased more rapidly in the DDP and DP.
- 조직학적인 평가를 위하여 술후 3, 7, 10, 14일째에 전체 창상을 적출하여 즉시 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한후 6 μm 두께로 잘라 헤마톡실린-에오진(Hematoxylin-Eosin) 염색을 하여 관찰하였다. 각 사용제재들의 시간 경과에 따른 창상치유 효과는 중성구의 수, 섬유모세포의 수, 신생 혈관의수, 창상의 상피화의 정도, 콜라겐 축적 정도로 크게 다섯 가지 항목으로 나누어 관찰하였다.
- 시료는 95℃에서 30초 반응 후 95℃에서 5초, 60℃에서 30초씩 40회 반응시켰다. 각 유전자의 상대적 정량을 위해 Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 발현 정도를 이용하여 보정하였다.
- 모든 군에서 3일에 한 번씩 드레싱을 시행하였다. 마스크 팩은 적당한 크기로 잘라 내용물을 충분히 적신 후창상에 20분간 처리하였고 팩의 처리가 끝나면 창상을 보호하기 위해 멸균된 TegadermⓇ (3M, USA)을 감싼 뒤 Peha haftⓇ (Paul Hartmann AG, Germany)와 Nylon 4-0를 이용하여 고정 봉합을 하여 Peha haftⓇ 가 흘러내리지 않도록 하였다(Fig. 1).
- 수술 시 백서를 졸레틸50Ⓡ (Virbac, Frances) 과 럼푼Ⓡ(Bayelkorea CO, Korea)을 각각 50 mg/kg과 10 mg/ kg으로 근육 주사하여 마취하였다. 마취한 백서의 등을 면도하여 털을 제거한 후 베타딘과 알코올로 소독하고 15번 칼과 조직가위를 이용하여 3군데 동일한 크기(지름 1 cm의 원형), 동일한 깊이(표피구조를 보정하는 표층 근막(superficial fascia)인 육상층(panniculus carnosus)을 보존하는 수준)의 전층피부창상을 만들었다. 모든 군에서 3일에 한 번씩 드레싱을 시행하였다.
- 마취한 백서의 등을 면도하여 털을 제거한 후 베타딘과 알코올로 소독하고 15번 칼과 조직가위를 이용하여 3군데 동일한 크기(지름 1 cm의 원형), 동일한 깊이(표피구조를 보정하는 표층 근막(superficial fascia)인 육상층(panniculus carnosus)을 보존하는 수준)의 전층피부창상을 만들었다. 모든 군에서 3일에 한 번씩 드레싱을 시행하였다. 마스크 팩은 적당한 크기로 잘라 내용물을 충분히 적신 후창상에 20분간 처리하였고 팩의 처리가 끝나면 창상을 보호하기 위해 멸균된 TegadermⓇ (3M, USA)을 감싼 뒤 Peha haftⓇ (Paul Hartmann AG, Germany)와 Nylon 4-0를 이용하여 고정 봉합을 하여 Peha haftⓇ 가 흘러내리지 않도록 하였다(Fig.
- 백서에서 일수 별로 적출한 창상조직은 실험 전까지 섭씨 영하 70℃에서 보관하였으며 조직 재생과 세포분화에 관여하는 중요 성장인자인 transforming growth factor (TGF)-β1과 혈관 생성에 영향을 주는 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현 정도를 real time PCR을 이용하여 분석하였다.
- 마그네슘이온뿐만 아니라 칼슘이온도 피부 장벽(barrier)의 기능회복에 중요하다. 본 연구에 사용된 해양심층수를 함유한 마스크 팩제와 해양심층수 및 사해염을 포함하는 마스크팩제의 1회분량(23 ml)에 포함된 칼슘의 농도는 각각 0.9798 mg, 1.7986 mg으로 두 군간에 적용된 칼슘의 절대치에 차이를 두었으며 또한 마그네슘 이온이 칼슘 이온보다 상대적인 수치가 높게 유지되도록 하였다(Table 3). Denda et al.
- 백서에서 일수 별로 적출한 창상조직은 실험 전까지 섭씨 영하 70℃에서 보관하였으며 조직 재생과 세포분화에 관여하는 중요 성장인자인 transforming growth factor (TGF)-β1과 혈관 생성에 영향을 주는 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현 정도를 real time PCR을 이용하여 분석하였다. 분석조직으로부터 trizol (Takara bio, Japan)을 이용하여 total RNA를 분리하고, iNtRON사의 RT premix kit를 사용 하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 2×SYBR Premix Ex Taq (Takara bio, Japan)을 사용하여 MJ mini thermal cycler system (Biorad, USA)으로 측정하였다.
- 술후 3일째 창상조직에서 real time PCR을 이용하여 VEGF 와 TGF-β1의 상대적인 mRNA의 발현을 분석하였다.
- 20마리의 백서의 등에 지름 1 cm 크기의 원형의 전층피부결손을 3곳에 만든 후 적용할 팩의 종류를 무작위로 할당하여 창상 치유에 미치는 창상의 위치에 대한 변수를 제거하였다. 실험 동물은 술후 3, 7, 10, 14일째 각 5마리를 희생하여 피부조직을 채취하였다. 수술 시 백서를 졸레틸50Ⓡ (Virbac, Frances) 과 럼푼Ⓡ(Bayelkorea CO, Korea)을 각각 50 mg/kg과 10 mg/ kg으로 근육 주사하여 마취하였다.
- 실험군은 창상형성 후 아무 것도 처치하지 않은 대조군(Control: CON), 해양심층수가 첨가된 마스크 팩을 처리한 실험군(Deep ocean water mask pack: DP), 해양심층수 및 사해염이 첨가된 마스크 팩을 처리한 실험군(Deep ocean water and Dead Sea salt mask pack: DDP)으로 총 3개로 분류하여 실험을 진행하였다.
- 조직학적인 평가를 위하여 술후 3, 7, 10, 14일째에 전체 창상을 적출하여 즉시 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한후 6 μm 두께로 잘라 헤마톡실린-에오진(Hematoxylin-Eosin) 염색을 하여 관찰하였다.
- 2). 창상의 면적은 시간이 지남에 따라 감소되는 창상의 면적을 측정하였으며, 최초의 창상면적을 기준으로 하여 백분 율로 환산해 그래프화하였다(Fig. 3). 그 결과 술후 4일째까지 대조군(78%), DDP군(67%), DP군(74%)에서 차이는 보이지 않았지만 모든 군에서 창상 면적이 유의하게 감소하였다.
- 창상의 테두리를 멸균 처리한 투명한 OHP 필름에 따라 그리고 스캔 하여 영상 분석 프로그램(NIH image analysis system, Bio-Optics사, USA)을 이용해 창상의 면적을 측정하였다. 창상의 면적은 처음 창상을 만들었을 때와 매번 팩을 처리 하기 전에 측정하였고, 구한 값을 토대로 처음 창상의 면적을 100%로 하고 그 뒤에 측정된 창상의 면적을 백분율로 환산하여 면적의 변화를 비교하였다.
- 창상의 테두리를 멸균 처리한 투명한 OHP 필름에 따라 그리고 스캔 하여 영상 분석 프로그램(NIH image analysis system, Bio-Optics사, USA)을 이용해 창상의 면적을 측정하였다. 창상의 면적은 처음 창상을 만들었을 때와 매번 팩을 처리 하기 전에 측정하였고, 구한 값을 토대로 처음 창상의 면적을 100%로 하고 그 뒤에 측정된 창상의 면적을 백분율로 환산하여 면적의 변화를 비교하였다.
- 합성된 cDNA는 2×SYBR Premix Ex Taq (Takara bio, Japan)을 사용하여 MJ mini thermal cycler system (Biorad, USA)으로 측정하였다.
- 해양심층수 및 사해염을 함유하는 마스크 팩은 2,200 mg/L의 농축해양심층수를 10% 첨가하고, 사해소금을 1.0% 첨가하여 총 미네랄이온이 226.5 mg/100 g, 마그네슘이온이 93.58 mg/100 g이 되도록 제조하였다. 또한 여러 보습성분들과 항산화성분들을 배합하여 균질화된 액상을 만들고, 이를 팩 내용물로 하여 얼굴형태의 부직포 1장에 충분히 적셔질 수 있도록 23 mL을 주입하여 밀봉하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 술후 3, 7, 10, 14일째 각 5마리를 희생하여 피부조직을 채취하였다. 수술 시 백서를 졸레틸50Ⓡ (Virbac, Frances) 과 럼푼Ⓡ(Bayelkorea CO, Korea)을 각각 50 mg/kg과 10 mg/ kg으로 근육 주사하여 마취하였다. 마취한 백서의 등을 면도하여 털을 제거한 후 베타딘과 알코올로 소독하고 15번 칼과 조직가위를 이용하여 3군데 동일한 크기(지름 1 cm의 원형), 동일한 깊이(표피구조를 보정하는 표층 근막(superficial fascia)인 육상층(panniculus carnosus)을 보존하는 수준)의 전층피부창상을 만들었다.
- 실험 동물은 온도 24±0.5℃, 습도 55-65% 및 12시간 주기로 명암이 자동으로 조절되는 사육조건 하에서 관리되었으며, 약 7일간 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험동물로는 체중 200 g-250 g의 Sprague-Dawley종 수컷 백서를 사용하였다. 실험 동물은 온도 24±0.
- 또한 여러 보습성분들과 항산화성분들을 배합하여 균질화된 액상을 만들고, 이를 팩 내용물로 하여 얼굴형태의 부직포 1장에 충분히 적셔질 수 있도록 23 mL을 주입하여 밀봉하였다. 해양심층수는 경북 울릉도 현포리 바다 4.7 km, 수심 650 m에서 취수한 것을 사용하였으며 사해소금은 ㈜ 바이롬사 에서 생산되는 것을 사용하였다. 시험에 적용된 해양심층수 및 사해염을 함유하는 마스크팩의 조성은 Table 1과 같다.
데이터처리
- , Chicago, USA)을 이용하여 통계 처리하였다. 실험군의 통계학적 유의성은 unpaired t-test방법과 ANOVA test로 검증하였고 유의수준은 5%미만에 두었다.
- 측정된 값은 평균±표준편차로 표시하였으며, SPSS 프로 그램(SPSS for windows 11.0, SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 통계 처리하였다.
성능/효과
- RT-PCR을 이용한 생화학적 검사상에도 술후 3일째 VEGF와 TGF-β1의 발현이 DDP 군에서 대조군보다 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었으며, VEGF의 경우 DDP군과 DP군에서 유의적 차이는 없었으나 TGF-β1발현은 DDP군이 DP군 보다 유의적으로 높아진 것을 확인할 수 있었다.
- 3). 그 결과 술후 4일째까지 대조군(78%), DDP군(67%), DP군(74%)에서 차이는 보이지 않았지만 모든 군에서 창상 면적이 유의하게 감소하였다. 술후 7일째 전후부터 군간의 차이가 나타나기 시작하여, 대조군의경우 창상면적이 술후 7일째 47%였으나 DDP군의 경우 29%, DP군 의 경우 36%로 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다.
- 그 결과, DDP군에서 VEGF와 TGF-β1가 가장 높게 발현되었으며, 이는 대조군 보다 VEGF의 경우 2.7배, TGF-β1의 경우 39배 높은 수치였다.
- 4를 넘어야 한다고 하였다(Grzesiak and Pierschbacher, 1995). 따라서 본 연구의 실험을 통하여 칼슘이 창상 치유에 중요한 역할을 한다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었으며, 해양심층수 및 사해염이 포함된 마스크 팩제가 피부재생에 도움이 된다는 것을 알 수 있었다.
- 하지만 술후 7일째 DDP군과 DP군에서 대조군 보다 중성구의 침윤이 적었으며 섬유모세포의 수와 신생 혈관의 수가 유의하게 많은 것으로 나타났다. 또한 대조군에 비하여 DDP 군과 DP군에서 술후 10일째 중성구의 침윤은 유의하게 줄었으며 collagen deposition양은 많은 것으로 관찰되었다(Fig. 4).
- Grzesiak and Pierschbacher (1995) 은 돼지와 쥐 동물 실험을 통하여 마그네슘 이온이 창상 치유 초기에 높은 농도로 관찰되는 것을 확인하였으며 이를 통해 마그네슘 이온이 창상 치유의 초기에 세포의 이동(migration)에 중요한 역할을 한다고 보고하였다(Grzesiak and Pierschbacher, 1995). 본 실험에서는 술후 7일째 시행한 조직학적 검사 소견상 DDP군과 DP군에서 대조군에 비하여 중성구의 수가 적게 관찰되었으며 섬유모 세포의 수는 많이 관찰되었다. 또한 DP군에 비하여 DDP군에서 섬유모세포의 수가 많이 관찰되었으며 이는 사해염에 포함된 마그네슘 이온이 창상 치유의 초기 세포의 이동에 영향을 미친 것으로 생각된다.
- 본 연구에서도 사해염을 추가함으로써 마그네슘이온의 함량의 차이를 두었으며 두 팩 제 간의 피부장벽에 미치는 영향이다른 것을 확인할 수 있었다. 술후 7일째 아무런 처치도 하지 않은 대조군에 비하여 DP군과 DDP군에서 육안적 창상 치유의 효과가 확인이 되었으며 이는 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
- 술후 3일째 모든 군에서 중성구의 침윤이 관찰되었으며, 술후 7일째에는 모든 군에서 중성구의 침윤이 증가된 소견을 보 였다. 하지만 술후 7일째 DDP군과 DP군에서 대조군 보다 중성구의 침윤이 적었으며 섬유모세포의 수와 신생 혈관의 수가 유의하게 많은 것으로 나타났다.
- 본 연구에서도 사해염을 추가함으로써 마그네슘이온의 함량의 차이를 두었으며 두 팩 제 간의 피부장벽에 미치는 영향이다른 것을 확인할 수 있었다. 술후 7일째 아무런 처치도 하지 않은 대조군에 비하여 DP군과 DDP군에서 육안적 창상 치유의 효과가 확인이 되었으며 이는 통계학적으로 유의한 차이가 있었다. 하지만 마그네슘 이온의 함량이 높은 DDP군에서 DP 군보다 초기 창상 치유가 빨리 이루어 졌으며 이는 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(p-value: 0.
- 그 결과 술후 4일째까지 대조군(78%), DDP군(67%), DP군(74%)에서 차이는 보이지 않았지만 모든 군에서 창상 면적이 유의하게 감소하였다. 술후 7일째 전후부터 군간의 차이가 나타나기 시작하여, 대조군의경우 창상면적이 술후 7일째 47%였으나 DDP군의 경우 29%, DP군 의 경우 36%로 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다. 특히 대조군에 대한 창상 면적의 감소율이 DDP군의 경우 통계학적 유의성이 0.
- 1%로 유의성이 5%인 DP군보다 대조군에 대하여 더 높은 유의한 차이를 보여주었다. 술후 9일째, 대조군에 대한 DDP군과 DP군의 창상 면적은 통계학적으로 유의한차이가 나타났으나 술후 11일째부터는 각 실험군 간 통계학적 으로 유의한 차이가 없었다.
- 조직학적 소견 상 술후 3일째 모든 군에서 급성 염증기의 중요한 역할을 하는 중성구의 침윤이 보였으나 술후 7일째 중성구의 수가 대조군에 비하여 DP군과 DDP 군에서 적게 관찰되었으며, 특히 DDP군이 DP군 보다 적은 것으로 관찰되었다. 이는 육안적 실험 결과와 일치하며, 사해염에 포함된 마그네슘이온이 급성 염증기를 줄여주고 창상 치유의 다음 단계로의 이행을 도와줌으로써 창상 치유의 효과를 가속화시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 이번 연구를 통하여 사해염이 피부 장벽에 미치는 육안적, 조직학적, 생화학적 영향을 확인할 수 있었다. 사해염을 함유한 마스크팩은 다른 팩제제 보다 외부 자극에 의하여 손상된 피부의 초기 염증 반응을 줄일 수 있었으며, 또한 수축의 주된 역할을 하는 섬유 모세포와 창상 치유 초기의 염증 세포들의 이동에 영향을 미쳐 창상 치유를 촉진 시키는 것으로 여겨진다.
- 또한, 이결과는 창상의 육안적 관찰 소견 이외의 조직학적 검사에서도 동일한 소견을 보였다. 조직학적 소견 상 술후 3일째 모든 군에서 급성 염증기의 중요한 역할을 하는 중성구의 침윤이 보였으나 술후 7일째 중성구의 수가 대조군에 비하여 DP군과 DDP 군에서 적게 관찰되었으며, 특히 DDP군이 DP군 보다 적은 것으로 관찰되었다. 이는 육안적 실험 결과와 일치하며, 사해염에 포함된 마그네슘이온이 급성 염증기를 줄여주고 창상 치유의 다음 단계로의 이행을 도와줌으로써 창상 치유의 효과를 가속화시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 창상은 모든 군에서 치유기간 동안 서서히 감소되어 술후 11일에서 14일 사이에 대부분의 창상이 치유된 것으로 나타났다 (Fig. 2). 창상의 면적은 시간이 지남에 따라 감소되는 창상의 면적을 측정하였으며, 최초의 창상면적을 기준으로 하여 백분 율로 환산해 그래프화하였다(Fig.
- 술후 7일째 전후부터 군간의 차이가 나타나기 시작하여, 대조군의경우 창상면적이 술후 7일째 47%였으나 DDP군의 경우 29%, DP군 의 경우 36%로 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다. 특히 대조군에 대한 창상 면적의 감소율이 DDP군의 경우 통계학적 유의성이 0.1%로 유의성이 5%인 DP군보다 대조군에 대하여 더 높은 유의한 차이를 보여주었다. 술후 9일째, 대조군에 대한 DDP군과 DP군의 창상 면적은 통계학적으로 유의한차이가 나타났으나 술후 11일째부터는 각 실험군 간 통계학적 으로 유의한 차이가 없었다.
- 술후 3일째 모든 군에서 중성구의 침윤이 관찰되었으며, 술후 7일째에는 모든 군에서 중성구의 침윤이 증가된 소견을 보 였다. 하지만 술후 7일째 DDP군과 DP군에서 대조군 보다 중성구의 침윤이 적었으며 섬유모세포의 수와 신생 혈관의 수가 유의하게 많은 것으로 나타났다. 또한 대조군에 비하여 DDP 군과 DP군에서 술후 10일째 중성구의 침윤은 유의하게 줄었으며 collagen deposition양은 많은 것으로 관찰되었다(Fig.
후속연구
- 사해염을 함유한 마스크팩은 다른 팩제제 보다 외부 자극에 의하여 손상된 피부의 초기 염증 반응을 줄일 수 있었으며, 또한 수축의 주된 역할을 하는 섬유 모세포와 창상 치유 초기의 염증 세포들의 이동에 영향을 미쳐 창상 치유를 촉진 시키는 것으로 여겨진다. 따라서 사해염을 함유하는 마스크팩을 이용하여 피부 재생의 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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