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문제 정의
- 황금으로부터 baicalin 화합물 추적분리는 활성분획으로부터 silica gel, sephadex LH-20, RP-silica gel 등의 각종 matrix를 적절히 이용하고, 다양한 용출용매로 column chromatography를 실시하였다. Low pressure liquid chromatography (LPLC), medium pressure liquid chromatography (MPLC) 또는 high pressure liquid chromatography (HPLC) 등을 이용하여 미량 성분이나 정제가 어려운 화합물을 확보하고, 최종적으로 분리된 화합물을 정제하여 최종 활성 확인 및 화합물의 구조를 확인하기 위한 시료로 조제하였다.
- 이 연구는 한약재로 주로 이용되고 있는 A. annua, P. chinensis, C. chinensis 및 S. baicalensis를 선발하여 콕시듐 억제 효능을 평가하여 사료첨가제로의 사용 가능성을 알아보고자 하였으며, 실험 결과 S. baicalensis가 콕시듐을 부분적으로 억제하는 효과가 있었음을 확인하였다. 이중 S.
- 이 연구에서는 그간 양계 분야에서 콕시듐으로 인한 고질적인 피해를 최소화하고자 S. baicalensis를 포함한 4종의 한약재 부산물을 선정하여 항콕시듐 합제를 제조하고, 각 물질에 대한 실험실적인 항콕시듐효과 검증과 야외실험을 통하여 그 방어 효과를 알아보고자 하였다.
- baicalensis은 40종 이상의 flavonoids를 함유하고 있는데 그 중 baicalin, chrysin, oroxylin-A, oroxylin-A-7-Oglucuronide, wogonin, wogonoside, skullcapflavone, dihydrobalcalin 등이 주요성분이다(Gao 등, 2008). 한의약 고서에 따르면 특히 황금은 독이 없고, 해열, 지사 및 소염 효과가 있어서 강장제로 주로 이용됐는데, 한약재 원료로 사용된 후에 버려지는 부산물을 사료첨가제로 개발하고자 이들 성분의 항콕시듐 효과를 우선하여 시험하게 되었다. 그 결과 한약재를 경구투여하지 않은 대조군에서 장 위해도가 4.
제안 방법
- Agilent 6410 LC/MASS와 Agilent 1200 HPLC를 이용하여 baicalin 5 mg을 MeOH에 녹여 10.0, 5.0, 1.0 그리고 0.5 mg/L의 표준용액을 조제하여 검량선을 작성하고 시료 중 각 물질의 농도를 LC MS/MS로 분석하였다.
- E. tenella 인공감염에 따른 장병변의 정도를 Johnson와 Reid(1970) 방법을 응용하여 맹장 부위의 비후, 변색, 크기변화, 내용물에 따라 0∼4+까지 병변이 거의 없는 것을 0으로 가장 심한 것을 4로 표시, 시험 처리구의 개체의 지수를 합산 평균하여 표시하였다.
- tenella 인공감염에 따른 장병변의 정도를 Johnson와 Reid(1970) 방법을 응용하여 맹장 부위의 비후, 변색, 크기변화, 내용물에 따라 0∼4+까지 병변이 거의 없는 것을 0으로 가장 심한 것을 4로 표시, 시험 처리구의 개체의 지수를 합산 평균하여 표시하였다. OPG는 감염 후 5일째부터 실험 종료일까지 매일 Macmaster chamber로 분변 중의 oocyst 배설량으로 산정하였다.
- Sampietro 등(2009)의 방법을 수정 보완하여 지표물질 확인을 위한 성분 분리분석을 하였다. 즉 개별 생약제 중에서 항콕시듐 효과가 가장 인정되는 그늘에서 건조하여 세절한 황금을 80% methanol로 추출한 후 감압 농축하고, 여액 및 잔사추출액을 합하여 감압 농축하였다.
- 각 추출물 및 분획물에 대하여 silica gel, octadecylsilyl (ODS) 및 thin layer chromatography (TLC)를 이용하여 전개하고, UV lamp, 10% 황산수용액, dragendorrf 시약, FeCl3 시약, ninhydrin 시약을 이용하여 발색하고, TLC에 있어서의 전개용매에 따른 Rf 값 등으로부터 함유성분의 계통을 추정하였다.
- 감염 5일째부터 분변으로부터 oocyst 검출을 확인하여, 2.5% potassium dichromate액에 부유시킨 다음 28oC에서 48∼72시간 동안 배양하여 포자충란을 얻은 다음 4oC에 저장하면서 실험에 사용하였다.
- 극성별 분획물 조제를 위해 물로 현탁한 후, 분액여두에서 ethyl acetate (EtOAc)를 이용하여 3회 추출하고, 추출액을 합한 후, 무수 MgSO4로 탈수, 여과, 감압 농축한 뒤, 남은 수층을 n-butanol로 2회 추출하고, 추출액을 합하여 감압 농축하였다. 각 추출물 및 분획물에 대하여 silica gel, octadecylsilyl (ODS) 및 thin layer chromatography (TLC)를 이용하여 전개하고, UV lamp, 10% 황산수용액, dragendorrf 시약, FeCl3 시약, ninhydrin 시약을 이용하여 발색하고, TLC에 있어서의 전개용매에 따른 Rf 값 등으로부터 함유성분의 계통을 추정하였다.
- 농장에서의 항콕시듐 활성을 측정하기 위하여 A. annua, P. chinensis, C. chinensis 및 S. baicalensis 한약재 추출물을 사료 중량 기준 0.2%의 양으로 육계배합사료에 첨가한 후 충남 예산군 삽교읍 H 농장, 경기 이천시 오천 J 농장에서 각기 20,000수의 닭을 시험군과 대조군으로 나누어 폐사율 변화, 증체량 변화 및 생산효율지수 변화를 각각 조사하였다. 생산효율지수(production efficiency factor index)는 육성률(100-폐사율)에 평균체중을 곱한 값을 출하일령과 사료요구율(육계 체중 1 kg을 증체하는데 사용된 사료량)로 나눈 값으로 하였으며, 그 계산식은 육성률(%)=100-폐사율, 사료요구율=육계 증체 1 kg/사료량, 생산지수=(육성률×평균체중/출하일령/사료요구율)×100으로 각각 구하였다.
- 또한, dragendorff 시약에 대한 발색양상으로부터 알칼로이드 성분의 정성, FeCl3 시약을 이용하여 페놀산 성분의 정성, ninhydrin 시약에 대한 발색양상으로부터 아미노산 및 peptide의 정성 분석을 하였다. 황금으로부터 baicalin 화합물 추적분리는 활성분획으로부터 silica gel, sephadex LH-20, RP-silica gel 등의 각종 matrix를 적절히 이용하고, 다양한 용출용매로 column chromatography를 실시하였다.
- 생산효율지수(production efficiency factor index)는 육성률(100-폐사율)에 평균체중을 곱한 값을 출하일령과 사료요구율(육계 체중 1 kg을 증체하는데 사용된 사료량)로 나눈 값으로 하였으며, 그 계산식은 육성률(%)=100-폐사율, 사료요구율=육계 증체 1 kg/사료량, 생산지수=(육성률×평균체중/출하일령/사료요구율)×100으로 각각 구하였다.
- 장 위해도 조사 시에 채취한 맹장 조직을 10% formalin에 고정한 후 일반 조직 검사방법에 따라 처리한 뒤 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 준비된 4종의 한약재를 육계 병아리(Samhwa Breeding Co., Ross)에 생후 2주째부터 1%액 음수생약을 신선하게 제조하여 매일 자유 급여형태로 투약하였다.
- Sampietro 등(2009)의 방법을 수정 보완하여 지표물질 확인을 위한 성분 분리분석을 하였다. 즉 개별 생약제 중에서 항콕시듐 효과가 가장 인정되는 그늘에서 건조하여 세절한 황금을 80% methanol로 추출한 후 감압 농축하고, 여액 및 잔사추출액을 합하여 감압 농축하였다.
- 황금 등의 한방 생약제를 음수 첨가제로 하여 E. tenella 감염에 미치는 영향을 실험적으로 관찰하고, 야외에서 닭 콕시듐증에 의한 피해 감소 효과를 알아보고자 시험을 수행하여 얻은 결과는 다음과 같다.
- 시약을 이용하여 페놀산 성분의 정성, ninhydrin 시약에 대한 발색양상으로부터 아미노산 및 peptide의 정성 분석을 하였다. 황금으로부터 baicalin 화합물 추적분리는 활성분획으로부터 silica gel, sephadex LH-20, RP-silica gel 등의 각종 matrix를 적절히 이용하고, 다양한 용출용매로 column chromatography를 실시하였다. Low pressure liquid chromatography (LPLC), medium pressure liquid chromatography (MPLC) 또는 high pressure liquid chromatography (HPLC) 등을 이용하여 미량 성분이나 정제가 어려운 화합물을 확보하고, 최종적으로 분리된 화합물을 정제하여 최종 활성 확인 및 화합물의 구조를 확인하기 위한 시료로 조제하였다.
대상 데이터
- Artemisia annua (청호), Pulsatilla chinensis (백두옹), Clematis chinensis (위령선) 및 S. baicalensis (황금)를 한약 제조상으로부터 구입하여 건조중량 250 g를 2,500 ml에 중탕하여 1,000 ml까지 증발 농축한 뒤 거즈로 여과하여 4oC에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 전북대학교에서 분리하여 사용해온 E. tenella를 실험실에서 계대하여 사용하였다. 즉, 육계 병아리(Samhwa Breeding Co.
- 즉, 육계 병아리(Samhwa Breeding Co.: Ross)를 구입하여 3주간 사육하여 실험실 적응 후 1×104 E. tenella (FJ447864)를 경구 감염시켰다.
성능/효과
- 1. 4가지의 한방 생약제제 중에서 가장 효과가 있는 것은 황금으로 확인되었으며, 이의 지표물질은 bicalein으로 13 μg/ml로 확인되었다.
- 2. 0.2% 음수용액으로 하여 E. tenella에 대한 방어 효과 시험에서는 황금을 공급한 닭에서 oocyst에 감염률이 14% 정도 떨어지는 것을 확인하였다.
- 3. 야외 실험에서는 사료효율과 증체량 조사에서는 한약재로 첨가한 시험군에서 더 적은 양의 사료 요구율로 폐사율은 낮아지고 출하 평균체중과 증체율, 생산지수는 증가하였다.
- E. tenella 감염시킨 후 7일째부터 맹장 조직에 대한 결과는 Fig. 2에서처럼 뚜렷한 분열생식포자와 oocyst를 관찰할 수 있었으며, 대조군보다 실험군의 조직 변화양상은 맹장 상피손상 정도와 출혈 등의 소견으로 볼 때 상대적으로 양호하게 확인되었다.
- E. tenella에 대한 배출억제 효과에서는 감염 5일째부터 oocyst의 배출 정도를 확인해 본 결과 대부분 7일째에 oocyst 배출 peak를 보였고, 한약재를 먹이지 않은 대조군의 경우 7일째에 600,000개의 oocyst가 검출되는 등 비슷한 수치를 보였지만, S. baicalensis를 먹인 군에서는 400,000개의 oocyst가 확인되어 14%정도를 억제시키는 것을 확인하였다.
- S. baicalensis의 항콕시듐 효과를 알아보기 위한 야외 실험 결과 충남 예산군 삽교읍 H 농장, 경기 이천시 오천 J 농장에서 S. baicalensis를 첨가하지 않은 일반 사료를 먹인 대조군과 사료 중량대비 0.2% 첨가한 사료를 급여한 시험군에서 평균체중이 1,350 g ± 20.36과 1,700 g ± 19.43이었으며, J 농장에서는 1,550 g ± 29.74과 1,670 g±27.58을 각각 나타내었다.
- 8로 우수 효과가 인정되었다(Table 1). 감염 후 OPG 결과는 Fig. 1에서 보는 바와 같이 E. tenella 감염 7일째에 대부분 peak를 보였고, 이중 S. baicalensis처리 군에서 g당 40만 개 수준으로 타 군보다 14% 정도 감소하는 효과를 확인하였다.
- 한의약 고서에 따르면 특히 황금은 독이 없고, 해열, 지사 및 소염 효과가 있어서 강장제로 주로 이용됐는데, 한약재 원료로 사용된 후에 버려지는 부산물을 사료첨가제로 개발하고자 이들 성분의 항콕시듐 효과를 우선하여 시험하게 되었다. 그 결과 한약재를 경구투여하지 않은 대조군에서 장 위해도가 4.0인데 비해 C. chinensis와 P. chinensis를 투여한 닭에서는 3.7로 떨어졌으며, S. baicalensis를 경구투여 한 닭에서는 2.5로 현저하게 떨어져 콕시듐 원충을 억제하는 것을 입증하게 되었다. 콕시듐 원충은 장 위해도에 비례하기 때문에 콕시듐 원충이 많으면 장 위해도가 높고 원충의 수가 적으면 장 위해도가 낮아지는 것을 확인하였고, 4가지 한약재를 혼합한 혼합제제를 1% 음수용액으로 경구투여한 결과에서는 장 위해도가 2.
- 8로 좋은 효과가 입증되었다. 따라서 산업적인 측면을 고려했을 때 4가지 한약재를 혼합하여 콕시듐 억제 사료첨가제로 개발되면 더욱 효율적일 것으로 생각하였다.
- 맹장 부검 소견에서는 뚜렷이 oocyst를 관찰할 수 있었으며, 많은 출혈 소견과 함께 발육단계별 oocyst가 관찰되었다. 이는 E.
- 실험실에서의 결과를 토대로 야외 현장에서의 효능평가를 확인하기 위해 2곳의 대단위 농장에서 S. baicalensis를 첨가하지 않은 사료를 먹인 대조군과 S. baicalensis를 사료 중량대비 0.2% 첨가한 시험군을 비교해본 결과 시험군의 경우 월등하게 좋은 증체효과와 생산지수를 각각 나타내었다. 폐사율 또한 대조군의 경우 300수지만 실험군에서는 20수로 더욱 확실한 차이를 확인할 수 있었다.
- 맹장 부검 소견에서는 뚜렷이 oocyst를 관찰할 수 있었으며, 많은 출혈 소견과 함께 발육단계별 oocyst가 관찰되었다. 이는 E. tenella가 포자를 형성하여 맹장의 상피세포를 파괴함으로써 생기는 것이며, 장관 점막에 손상을 주면서 증식함으로써 장점막에 심한 손상시켜, 혈변과 함께 배설되고 있음을 확인하였다. 그동안 이러한 문제를 해결하기 위해 많은 항콕시듐제가 개발되고 있지만, 기존의 항콕시듐제는 내성을 지닌 콕시듐 원충에 의해 그 한계에 직면하였다.
- 이상의 결과를 종합 검토한 결과 한방 생약제 각각에 대한 항콕시듐 효과에서는 황금이 가장 우수하게 관찰이 되었으며, 야외에서의 시험결과 이들의 현장 적용을 위해서는 황금 성분만을 활용하기에는 경제성의 문제가 있어, 본 시험의 야외시험 결과를 볼 때 복합제제로 개발하여 적용하는 것이 가장 바람직할 것으로 생각하였다.
- 장 위해도 조사에서는 P. chinensis와 C. chinensis 첨가 군에서 평균 3.7로 가장 높았으며, A. annua의 경우는 3.5인 반면 가장 효과가 좋은 것은 S. baicalensis로서 2.5로서 가장 효능이 좋게 관찰되었다. 한편, 이들 혼합 제제화한 경우 2.
- 주요 지표물질로 확인된 bicalein은 7.45분에 최고치 함량을 나타내었고, 그 함량은 13 μg/ml을 나타내었다(Fig. 3).
- 즉, artemisinin를 5∼50 ppm으로 경구투여할 경우 생존율에는 차이가 없었으나, 특징적 임상증상인 혈변의 출현이 늦고 미약하였으며, 병변 또한 낮게 나오는 것을 확인하였다.
- 5로 현저하게 떨어져 콕시듐 원충을 억제하는 것을 입증하게 되었다. 콕시듐 원충은 장 위해도에 비례하기 때문에 콕시듐 원충이 많으면 장 위해도가 높고 원충의 수가 적으면 장 위해도가 낮아지는 것을 확인하였고, 4가지 한약재를 혼합한 혼합제제를 1% 음수용액으로 경구투여한 결과에서는 장 위해도가 2.8로 좋은 효과가 입증되었다. 따라서 산업적인 측면을 고려했을 때 4가지 한약재를 혼합하여 콕시듐 억제 사료첨가제로 개발되면 더욱 효율적일 것으로 생각하였다.
- 황금의 성분을 분리한 결과 wogonin, bicalein, oroxylin A의 peak는 각각 8.64, 7.44, 8.94분에서 나타났다. 주요 지표물질로 확인된 bicalein은 7.
후속연구
- 이번 연구는 한약재를 이용하여 닭콕시듐병 억제제에 관한 실험적 결과로 한약재 중에서도 S. baicalensis의 항콕시듐 효과에 대한 최초의 보고로 한약재를 활용한 항콕시듐제의 연구에 많은 도움이 될 것으로 보이며, 황금 성분 중에 bicalein 외에도 40여 종 flavonoids의 항콕시듐 작용 및 면역 증강 등의 연구가 더 진행되고, 다른 천연물 성분들과 혼합하여 사용 될 경우 콕시듐으로 인한 농가 피해를 최소화하는데 기여하는 바가 매우 클 것으로 생각하였다.
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