[논문]청화탕(淸華湯)의 항산화 및 항염증 효능

김진우; 김선빈; 오정민; 윤미영; 이기무; 김동희

청화탕(淸華湯)의 항산화 및 항염증 효능
Effect of CHT in anti-oxidative and anti-inflammatory related factors 원문보기

論文集 : 大田大學校韓醫學硏究所. 韓醫學編, v.20 no.2, 2012년, pp.29 - 39

김진우 (대전대 한의과대학 병리학교실) , 김선빈 () , 오정민 , 윤미영 () , 이기무 , 김동희 (대전대 한의과대학 병리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

To investigate the clinical aspects of CHT in atopic dermatitis (AD) treatments, the effect of CHT in anti-oxidative and anti-inflammatory cytokines were tested. 100% or higher cell viability was observed in all tested groups from 25 to 200 ${\mu}g/m{\ell}$ using Raw 264.7 cells. CHT showed dose-dependent DPPH scavenging activity, with more than 90% scavenging activities at 800 ${\mu}g/m{\ell}$ concentrations. CHT showed dose-dependent suppression activity of ROS production, especially at 200 ${\mu}g/m{\ell}$ of 37.5%. CHT decreased NO production activity, with significant decrease of 33.2% at 200 ${\mu}g/m{\ell}$. IL-6, MCP-1, TNF-${\alpha}$ production rate were decreased by approximately 25% when Raw 264.7 cells were treated with LPS and with CHT of 200 ${\mu}g/m{\ell}$. Also, IL-$1{\beta}$ production rate was decreased by 25% at 100 ${\mu}g/m{\ell}$. The results above indicate that CHT significantly reduces the effect of oxidative and inflammatory cytokines. The use of CHT in dermatitis can be widely suggested.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 실험에서는 보다 유의성 있는 치료 처방의 개발을 위한 기초 연구와 더불어 피부 질환에 활용되고 있는 임상 활용방에 대한 객관적 규명을 위하여 ‘淸華湯(CHT)’을 시료로 항산화 및 항염증 효능에 관련된 기본적인 실험을 진행하여 유의성을 평가하였다.

제안 방법

150 mM DPPH/EtOH 150 ㎕에 CHT를 25, 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 100 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이를 ELISA reader를 이용하여 wave length 517nm에서 흡광도를 측정한 후 아래의 방법으로 계산하였다.
48 well plate에 Raw 264.7 세포를 2 × 105/well/400 ㎕씩 첨가하고 LPS 1㎍/㎖ 및 CHT 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도를 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
6 well culture plates에 Raw 264.7 세포를 3 × 105 cells/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, CHT 각각의 농도를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖을 처리하여, 다시 24시간 동안 배양하였다.
CHT의 세포독성 여부를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포를 이용하여 세포독성을 확인하였다. Raw 264.
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. Raw 264.
N1 buffer를 50 ㎕를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소반응 후, N2 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
배양 종료 후 DCF-DA 10 μM을 처리하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 배양한 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 ㎕를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 ROS를 측정하였다.
배양 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-a를 custom- made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다.
시료 추출 방법은 CHT 2첩을 한약 유출기에 넣고, 증류수 1200 ㎖과 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 흡입 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 CHT를 분리한 후, 다시 동결 건조기에서 24시간 동결건조하여 분말 26.
항산화 및 염증 실험에 앞서 시료에 대한 세포독성을 평가하였다. 실험 농도를 설정하기 위한 Raw 264.
항산화 효능 평가는 가장 기본적으로 사용되는 DPPH free radical 소거 활성과 ROS (reactive oxygen species) 생성량을 측정하였다.

대상 데이터

Raw 264.7 세포 내에서 reactive oxygen speies (ROS)를 측정하기 위하여 2',7'- Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)를 이용하였다.
본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA Co, Japan), CO2 incubator (Sanyo Co, Japan), autoclave, deep-freezer (Nihon Co, Japan), clean bench, water bath, vortex mixer, heating block, Ice Flaker Machine (Icematic Co, Italy), plate shaker (Lab-line Co, USA), flow cytometer (Becton Dickinson, USA), centrifuge (Hanil Co, Korea), 48well microchamber (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, USA), ELISA reader (Molecular Devices, Co, USA), Luminex (Millipore, Co, USA) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용한 淸華湯 (Chunghwatang ; 이하 CHT)의 구성 약재들은 대전대학교 난치성면역질환의 동서생명의학연구센터 (TBRC)에서 구입하여 정선하여 사용하였고, 그 내용과 분량 (1첩)은 다음과 같다.
실험에 사용된 시약 중 trypan-EDTA, acetic acid, tris-base, tris-HCl, dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2',7'- Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) 등은 Sigma (USA)사 제품을, MTT assay kit (EZ CyTox)는 Daeil Lab Service (Korea)사 제품을, NO assay kit는 인트론 바이오 (Korea)사 제품을, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ Milliplex panel (IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α)은 Millipore (USA)사 제품을 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.

데이터처리

Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**, p<0.01).
Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05, **, p<0.01).
The result were presented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (+++, p<0.001).
The result were presented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (++, p<0.01).
The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (+, p<0.05).
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error (S.E.)로 기록하였고, 유의성 검증은 Student＇s t-test 분석법을 이용하여 결정하였다.

이론/모형

배양 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-a를 custom- made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다. 분석은 Milliplex analyst를 통해 이루어 졌다.

성능/효과

CHT는 DPPH 소거능 평가 및 ROS 생성율에서 농도 의존적 효과를 나타내었고, 특히 DPPH 소거능 평가에서는 800 (㎍/㎖)의 농도에서 90% 이상의 소거 활성 효과를, ROS 생성율에서는 200 (㎍/㎖)의 농도에서 37.5% 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2, 3).
CHT은 CD3로 활성화된 비장세포에서 IL-4, IL-6, IL-13, IFN-γ, TNF-α 생성량을 대조군에 비해 각각 40.6%, 31.6%, 40.9%, 27.5%, 57.4%로 유의성 있게 감소시켰으며, IL-5 생성량은 12..8% 감소하였다.
CHT은 DPPH 소거 활성에서 농도 의존적으로 소거 활성을 나타내었으며, 800 ㎍/㎖ 농도에서 90% 이상의 소거 활성 효과를 나타내었다.
CHT은 LPS를 처리한 Raw 264.7 cells에서 대조군에 비해 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성량을 200 ㎍/㎖ 농도에서, IL-1β 생성량을 100 ㎍/㎖ 농도에서 약 25% 내외로 감소시켰다.
CHT은 NO 생성율을 대조군에 비해 감소시켰으며, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 33.2%의 유의성 있는 감소를 나타내었다.
CHT은 ROS 생성율을 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소시켰으며, 200 ㎍/㎖ 농도에서 37.5% 억제 효과를 나타내었다.
CHT은 Raw 264.7 cells에 대한 세포독성에서 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도 처리군에서 모두 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었다.
DCFH-DA 시약을 이용하여 Raw 264.7 세포내 생성되는 ROS 양을 측정한 결과, 대조군의 ROS 생성량이 100 (%) 일 때, CHT의 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도 투여군에서는 대조군에 비하여 각각 77.8, 75.6, 62.5 (%) 로 감소하였다 (Fig. 3).
Griess Reagent System을 이용하여 Raw 264.7 세포내 생성되는 NO 양을 측정한 결과, 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있는 (+, p<0.05) 증가를 나타내었고, 대조군의 NO 생성량이 100 (%) 일 때, CHT의 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도 투여군에서는 98.2 ± 7.1, 66.8 ± 2.9, 72.3 ± 9.8, 67.3 ± 5.6 (%) 으로 나타나 50 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (**, p<0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 4).
한의학에서 瘙痒症 병리는 風瘙痒, 風痒으로 불릴 정도로 實證에 있어서는 風邪와 연관이 있으며, 급․만성 모두에서 血熱과 血毒의 병리가 瘙痒症을 악화시킴과 동시에 염증을 심화시키는 것으로 인식하고 있다. 따라서 發散風寒, 發散風熱, 祛風止濕, 淸熱凉血, 淸熱解毒瀉火, 利尿通淋, 淸熱利濕, 消腫解毒 효능¹⁸⁾을 가진 약물로 구성된 본 방은 이러한 병리에 대하여 약물간의 상승 작용으로 유의성 있는 효과를 발휘할 수 있을 것으로 사료된다.
또한 본 시료가 LPS를 처리한 Raw 264.7 cells에서 분비되는 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성량은 200 ㎍/㎖ 농도에서, IL-1β 생성량은 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 약 25% 내외로 감소되어(Fig. 5-8), 본 시료의 염증 억제 효과를 객관적으로 확인할 수 있었다.
. 본 실험에서는 대식세포인 Raw 264.7 cells을 LPS로 자극하여 시료의 농도에 따른 NO 생성을 확인하였는데, 50 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 33.2% 억제시키는 유의성을 나타내었다(Fig. 4).
항산화 및 염증 실험에 앞서 시료에 대한 세포독성을 평가하였다. 실험 농도를 설정하기 위한 Raw 264.7 cell에 의한 세포독성 평가에서는 CHT는 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도로 처리한 모든 실험군에서 100% 이상의 세포 생존율을 나타내어 본 시료의 안전성을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).

후속연구

전체적인 실험이 가장 기본적인 염증 인자에 대한 검색으로 초점이 맞추어져 있어, 향 후 동물실험과 다양한 관련 인자들에 검색을 통하여 보다 정확한 효능 기전에 대한 검색이 있어야 할 것으로 보인다. 아울러 구성 약물에 대한 개별적인 검색을 통하여 약물간의 상호 작용에 관련된 한의학적 이론에 대한 객관적인 규명이 필요할 것으로 사료된다.
이상의 결과로 淸華湯(CHT)은 산화적 손상 및 염증 인자들에 대하여 유의성 있는 억제 효과가 객관적으로 검증됨으로써 피부 염증 질환에 보다 다양하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
전체적인 실험이 가장 기본적인 염증 인자에 대한 검색으로 초점이 맞추어져 있어, 향 후 동물실험과 다양한 관련 인자들에 검색을 통하여 보다 정확한 효능 기전에 대한 검색이 있어야 할 것으로 보인다. 아울러 구성 약물에 대한 개별적인 검색을 통하여 약물간의 상호 작용에 관련된 한의학적 이론에 대한 객관적인 규명이 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아토피피부염 치료 처방의 개발을 위한 기초연구와 더불어 피부 질환에 활용되고 있는 임상 활용방에 대한 객관적 규명을 위하여 ‘淸華湯 (CHT)’을 시료로 항산화 및 항염증 효능 관련 인자에 대한 검색을 진행하여 얻은 결론은?	CHT은 Raw 264.7 cells에 대한 세포독성에서 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도 처리군에서 모두 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. CHT은 DPPH 소거 활성에서 농도 의존적으로 소거 활성을 나타내었으며, 800 ㎍/㎖ 농도에서 90% 이상의 소거 활성 효과를 나타내었다. CHT은 ROS 생성율을 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소시켰으며, 200 ㎍/㎖ 농도에서 37.5% 억제 효과를 나타내었다. CHT은 NO 생성율을 대조군에 비해 감소시켰으며, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 33.2%의 유의성 있는 감소를 나타내었다. CHT은 LPS를 처리한 Raw 264.7 cells에서 대조군에 비해 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성량을 200 ㎍/㎖ 농도에서, IL-1β 생성량을 100 ㎍/㎖ 농도에서 약 25% 내외로 감소시켰다. CHT은 CD3로 활성화된 비장세포에서 IL-4, IL-6, IL-13, IFN-γ, TNF-α 생성량을 대조군에 비해 각각 40.6%, 31.6%, 40.9%, 27.5%, 57.4%로 유의성 있게 감소시켰으며, IL-5 생성량은 12..8% 감소하였다.
	염증 반응이란?	염증 반응은 조직 손상 또는 세균 감염 등에 의해 발생하는 것으로, 생체 조직이 다양한 원인에 의해 손상 받았을 때 손상된 부분을 정상화 시키고자 하는 면역 반응의 일부분이다2).
	염증의 증상으로는 어떤것들이 있는가?	염증 증상으로는 발열, 피로, 식욕 감퇴 등의 전신 증상과 발적, 발열, 종창, 동통 등의 국소 증상이 있는데, 병리조직학적으로는 혈관 투과성 항진과 과립구 및 대식세포와 같은 세포의 침윤이 특징이다19.20).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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