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문제 정의
- (2010)은 접종 농도가 정착 선충수와 수컷 체장에 영향을 주며 접종농도가 많을수록 왜화암컷(stunted female)의 비율이 증가한다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 선충의 수확 시기에 따른 크기별 병원성과 동일 크기의 기주에서 체장이 병원성과 기주정착, 증식에 어떤 영향을 미치며 체장은 다음세대 에도 영향을 주는지를 조사하였다.
- 본 연구는 곤충병원성 선충들 중 체장의 변이가 심하고, 기초적인 생태연구가 거의 없는 S. arenarium을 이용하여 침입태 유충의 체장 변이와 침입태 유충의 연령에 따라 선충의 병원성과 발육 및 증식에 미치는 영향을 알아 보고자 수행하였다.
제안 방법
- 5.5 × 15 mm 플라스틱 Petri dish에 여과지(Whatman #2, 55 mm) 2장을 깔고, 수확한 선충을 소형과 대형, 혼합집단으로 구분하여 각각 20마리/0.5 ㎖ 농도로 처리한 후 꿀벌부채명나방 노숙유충 한 마리씩을 넣었다.
- arenarium을 꿀벌부채명나방의 노숙유충에 접종하여 White trap (White, 1927)으로 수확한 뒤 실험에 사용하였다. S. arenarium은 해부현미경 하에서 체장이 짧은 소형 집단(636～923 ㎛)과 체장이 긴 대형집단(1209～1496 ㎛), 체장을 구분하지 않고 다양한 크기의 선충이 섞여 있는 혼합집단으로 구분하였다. 기주로 사용된 꿀벌부채명나방은 Lee et al.
- White trap은 24 ± 1℃의 항온기에 넣어 두고, 침입태 유충이 모두 탈출한 7일 후에 증식 수를 조사하였다.
- 2 g NaH2CO3, 1 ℓ 살균수)을 반쯤 담고 암컷과 수컷을 옮겨 담은 후 TAF 용액(7 ㎖ 40% formaldehyde, 2 ㎖ triethanolamine, 91 ㎖ 살균수)을 80℃로 가열하여 고정하였다. 고정시킨 선충은 MC Camera Moticam 2000과 Motic Images Plus version 2.0 ML (Motic사, 중국)을 이용하여 사진을 찍고 길이를 측정하였다. 반복수는 처리별로 치사된 꿀벌부채명나방의 수와 기주 체내에 정착한 수에 따라 상이하게 하여 조사하였다.
- 그리고 마이크로 파이펫을 이용하여 침입태유충을 뽑아내어 Ringer’s solution이 담겨있는 유리 Petri dish에 넣고 TAF 용액을 80℃로 가열하여 고정하였다. 고정시킨 침입태 유충은 성충과 같은 방법으로 사진을 찍어 체장을 측정하였다. 체장은 증식된 침입태 유충 1마리를 한 반복으로 120마리를 조사하였다.
- White trap은 직경 100 × 15 mm 크기의 유리 Petri dish에 50 mm 크기의 Petri dish 뚜껑을 넣고, 55 mm 여과지 (Whatman #2, 55 mm)를 부채꼴 모양으로 잘라 반쯤 걸친 후 살균수 15 ㎖을 바닥에 넣었다. 그리고 치사된 꿀벌부채명나방 유충 한 마리를 여과지 위에 걸쳐 놓았다. White trap은 24 ± 1℃의 항온기에 넣어 두고, 침입태 유충이 모두 탈출한 7일 후에 증식 수를 조사하였다.
- 꿀벌부채명나방 노숙유충에 S. arenarium을 체장별로 구분하여 접종하고 48시간 후에 현미경 하에서 해부한 결과, 모든 처리에서 처리한 유충은 성충으로 발육하였다. 3일째 수확하여 접종한 것에서 성충으로 발육한 선충의 수는 소형, 대형, 혼합집단에서 각각 1.
- 처리된 Petri dish는 polyethylene film에 싸서 통기를 위해 약 10개의 구멍을 뚫은 다음 24 ± 1℃의 항온기에 보관하였다. 대조구로는 살균수만 0.5 ㎖ 처리하였으며, 처리 24, 48, 72, 96시간 후 꿀벌부채명나방 유충의 치사여부를 조사하였다. 실험은 10개의 Petri dish를 한 반복 단위로 5반복으로 수행하였다.
- 0 ML (Motic사, 중국)을 이용하여 사진을 찍고 길이를 측정하였다. 반복수는 처리별로 치사된 꿀벌부채명나방의 수와 기주 체내에 정착한 수에 따라 상이하게 하여 조사하였다.
- 수확시기와 S. arenarium 침입태 유충의 체장의 변이가 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수확시기 및 S. arenarium 침임태 유충 체장이 병원성에 미치는 영향 실험과 같은 조건에서 치사된 꿀벌부채명나방 유충을 처리 후 5일째 White trap을 설치하였다. White trap은 직경 100 × 15 mm 크기의 유리 Petri dish에 50 mm 크기의 Petri dish 뚜껑을 넣고, 55 mm 여과지 (Whatman #2, 55 mm)를 부채꼴 모양으로 잘라 반쯤 걸친 후 살균수 15 ㎖을 바닥에 넣었다.
- 수확시기와 S. arenarium 침입태 유충의 체장이 기주 체내에서의 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수확시기 및 S. arenarium 침임태 유충 체장이 병원성에 미치는 영향 실험과 같은 조건에서 치사된 꿀벌부채명나방 유충을 처리 후 3일째 각 처리 당 치사된 기주를 임의로 선택하여 해부현미경하에서 해부하여 선충의 암, 수를 구분하여 조사하였다. 유리 Petri dish에 Ringer’s solution(9 g NaCl, 0.
- 수확시기와 S. arenarium 침입태 유충의 체장이 병원성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 선충이 기주를 탈출한 3일과 10일 째에 White trap으로부터 침입태 유충을 수확하였다. 5.
- 5 ㎖ 처리하였으며, 처리 24, 48, 72, 96시간 후 꿀벌부채명나방 유충의 치사여부를 조사하였다. 실험은 10개의 Petri dish를 한 반복 단위로 5반복으로 수행하였다.
- 유리 Petri dish에 Ringer’s solution(9 g NaCl, 0.4 g KCl, 0.4 g CaCl2, 0.2 g NaH2CO3, 1 ℓ 살균수)을 반쯤 담고 암컷과 수컷을 옮겨 담은 후 TAF 용액(7 ㎖ 40% formaldehyde, 2 ㎖ triethanolamine, 91 ㎖ 살균수)을 80℃로 가열하여 고정하였다.
- 고정시킨 침입태 유충은 성충과 같은 방법으로 사진을 찍어 체장을 측정하였다. 체장은 증식된 침입태 유충 1마리를 한 반복으로 120마리를 조사하였다.
대상 데이터
- arenarium은 해부현미경 하에서 체장이 짧은 소형 집단(636～923 ㎛)과 체장이 긴 대형집단(1209～1496 ㎛), 체장을 구분하지 않고 다양한 크기의 선충이 섞여 있는 혼합집단으로 구분하였다. 기주로 사용된 꿀벌부채명나방은 Lee et al. (2007)의 인공사료를 이용하여 실내에서 사육한 것을 사용하였는데, 실험 오차를 줄이기 위해 180～200 mg 이내의 노숙유충을 사용하였고 선충은 White trap 설치 후 2주 이내의 것을 사용하였다.
- 본 연구결과, 증식된 침입태 유충의 체장은 636～1496 ㎛ 사이로 다양하였다. Gouge and Hague(1995), Kakouli-Duarte and Hague(1999)는 S.
- 실험에 사용된 곤충병원성 선충 S. arenarium은 University of California Davis 선충학과의 Dr. Kaya 실험실에서 2003년 분양받아 꿀벌부채명나방(G. mellonella) 노숙유충을 이용하여 증식시켜 사용하였다(Woodring and Kaya, 1988). 9℃의 냉장고에 보관 중이던 S.
데이터처리
- S. arenarium 침입태 수확시기와 유충의 체장에 따른 꿀벌부채명나방의 치사율은 arcsin으로 변환시켜 분산분석 하였고(PROC ANOVA), Tukey test로 처리 평균간 차이를 검정하였다. 결과는 변환전의 평균 ± 표준편차로 표기하였다.
- 결과는 변환전의 평균 ± 표준편차로 표기하였다.
- 결과는 변환전의 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 발육수와 증식수, 길이는 Tukey test로 분산분석(PROC ANOVA)하였고, 처리간의 반복수가 다른 것은 Student-Newman-Keul test로 평균간 차이를 검정하였다(SAS Institute, 1999).
성능/효과
- 10일째 수확하여 접종한 것에서도 성충으로 발육한 선충의 수는 소형, 대형, 혼합집단에서 각각 5.3, 7.4, 7.6마리로 소형집단의 성충으로 발육한 수가 대형, 혼합집단보다 적었다(df=2, 57, F=4.44, P<0.0162)(Fig. 2B).
- S. arenarium의 침입태 유충 체장은 증식수에는 영향을 주지 않았다. 이것은 꿀벌부채명나방의 노숙유충이 S.
- S. arenarium의 침입태 유충의 수확 시기는 병원성에 영향을 미쳐 10일째에 수확한 것보다 3일 째에 수확한 선충의 병원성이 현저히 낮았다. 특히 10일째 수확한 선충의 경우 체장에 상관없이 처리 2일 후부터 동일한 병원성을 보였으나 3일째 수확한 선충은 체장이 짧은 선충을 접종한 처리구에서 병원성이 낮았다.
- 왜화암컷은 암컷의 형태를 모두 갖추고 있으며 보통의 암컷과 같은 생식활동을 할 수 있다. 그리고 수컷의 경우도 1300 ㎛이하의 작은 선충은 체장이 짧은 선충을 처리하였을 때에만 나타났으며 성숙 침입태 선충 처리보다 미성숙 침입태 유충 처리에서 높게 나타났다. 그러나 증식된 침입태 유충의 체장은 접종한 선충의 수확시기나 체장에 영향을 받지 않았다.
- arenarium의 침입태 유충의 수확시기가 병원성과 침입, 왜화암컷 성충의 발생에 영향을 미친다는 것과 침입태 유충의 체장이 발육에 영향을 미치지만 증식에는 영향을 미치지 않는다는 것이었다. 그리고 체장이 636～1496 ㎛로 변이의 폭이 넓다는 것과 꿀벌부채명나방 유충에 접종하여도 왜화암컷 성충이 발생한다는 새로운 사실들이었다. 이상의 결과들은 유충의 크기 차이가 생태적 특성에 미치는 영향에 대한 기초자료가 될 것이다.
- arenarium의 침입태 유충의 수확시기나 체장은 성충으로의 발육에 영향을 주었다. 기주를 침입하여 발육하는 시간에는 차이가 없었으나 침입한 수에는 차이가 있었으며 조기에 수확한 선충 처리구의 침입수가 White trap 설치 후 10일 째 수확한 선충의 침입수에 비하여 체장에 관계없이 모두 적었다. 그리고 선충의 체장이 짧은 선충을 접종 하였을 때가 체장이 긴 선충이나 혼합집단 처리에 비하여 침입수가 적었다.
- 꿀벌부채명나방 노숙유충에서 발육한 암컷의 체장은 다양하였는데, 3일째 수확하여 접종한 소형집단에서는 5,700 ㎛ 이하의 왜성 암컷(stunted female)의 발생이 50.0%로 10일째 수확하여 접종한 소형집단의 20.0%보다 많았다(Fig. 6).
- 꿀벌부채명나방 노숙유충에서 증식된 S. arenarium의 수는 3일째 수확하여 접종한 소형집단에서 10,138마리, 대형집단에서 13,606마리, 혼합집단에서 10,294마리로 차이가 없었다(df=2, 31, F=0.65, P=0.5296). 10일째 수확하여 접종한 소형, 대형, 혼합집단에서 증식된 수도 각각 12,083, 14,033, 14,334마리로 차이가 없었다(df=2, 57, F=0.
- 꿀벌부채명나방 유충에서 발육한 선충의 체장은 처리별로 차이가 없었으나 작은 크기의 성충 발생비율은 소형 집단의 선충을 접종하였을 때 높게 나타났다. 그리고 모든 처리에서 왜화암컷 성충이 발생하였는데, 꿀벌부채명나방 노숙유충에서는 왜화암컷의 발생이 없다고 한 Kakouli-Duarte and Hague (1999)의 연구와는 상이한 결과를 보였다.
- 발육한 성충의 성비는 3일째 수확하여 처리한 모든 집단에서 차이가 없었고(df=2, 69, F=2.32, P<0.1063), 10일째 수확하여 처리한 것에서도 차이가 없었다(df=2, 72, F=1.52, P<0.2266) (Fig. 3).
- 본 실험의 결과 48시간 이내에 기주가 100% 치사되는 것으로 보아 기주의 치사는 24시간 이내의 초기에 침입한 선충에 의하여 유발되는 것으로 추정되어진다. 체장이 짧은 선충 처리에서 병원 성과 침입수가 불일치하는 것은 선충의 침입밀도와 병원성이 1:1 상관관계를 형성하지 않고, 체장이 짧은 선충의 이동이 긴 선충에 비하여 어렵기 때문으로 생각된다.
- 본 연구에서 새로이 확인된 결과는 S. arenarium의 침입태 유충의 수확시기가 병원성과 침입, 왜화암컷 성충의 발생에 영향을 미친다는 것과 침입태 유충의 체장이 발육에 영향을 미치지만 증식에는 영향을 미치지 않는다는 것이었다. 그리고 체장이 636～1496 ㎛로 변이의 폭이 넓다는 것과 꿀벌부채명나방 유충에 접종하여도 왜화암컷 성충이 발생한다는 새로운 사실들이었다.
- 수확시기가 다른 S. arenarium의 침입태 유충을 구분하여 꿀벌부채명나방에 처리한 결과, 3일째 수확하여 접종한 것은 소형 집단 접종 시 접종 후 5일 째 72%의 치사율을 나타내었고, 대형 집단과 혼합집단 접종 시에는 접종 후 5일 째에 94%의 치사율을 보여 침입태 유충의 체장은 병원성에 영향을 미치었다(F=79.8, df=3, 16, P<0.0001)(Fig. 1).
- 그리고 모든 처리에서 왜화암컷 성충이 발생하였는데, 꿀벌부채명나방 노숙유충에서는 왜화암컷의 발생이 없다고 한 Kakouli-Duarte and Hague (1999)의 연구와는 상이한 결과를 보였다. 왜화 암컷 성충의 비율은 미성숙 침입태 유충 처리에 비하여 성숙 침입태 유충 처리에서 낮았는데, 미성숙 침입태 유충 처리에서는 체장이 긴 처리에 비하여 짧은 체장 선충 처리에서 발생 비율이 높았다. 왜화암컷은 암컷의 형태를 모두 갖추고 있으며 보통의 암컷과 같은 생식활동을 할 수 있다.
- 증식된 침입태 유충의 체장은 3일째 수확하여 접종한 소형, 대형, 혼합집단에서 각각 1,100.7, 1,092.4, 1,142.7 ㎛로 차이가 없었으며(df=2, 357, F=0.91, P=0.4049), 10일째 수확하여 접종한 소형, 대형, 혼합집단에서도 각각 1,116.2, 1,137.6, 1,115.8㎛였다. 선충의 수확시기 및 체장에 따른 증식된 침입태 유충의 체장은 차이가 없었다(df=2, 357, F=1.
후속연구
- 그리고 체장이 636～1496 ㎛로 변이의 폭이 넓다는 것과 꿀벌부채명나방 유충에 접종하여도 왜화암컷 성충이 발생한다는 새로운 사실들이었다. 이상의 결과들은 유충의 크기 차이가 생태적 특성에 미치는 영향에 대한 기초자료가 될 것이다.
- 한편 S. arenarium은 Steinernema속의 다른 종들과는 달리 Wihte trap 설치 시에 치사된 꿀벌부채명나방을 얹은 여과지에 수분이 많이 흡수되지 않도록 하야야 하고, 기주를 탈출한 침입태 유충은 탈출 후 며칠의 일정한 시간을 거쳐야 높은 병원성을 가졌는데(Han, personal observation) 실내에서 본 선충을 대량증식하여 실험에 이용할 경우 이점을 고려하여야 할 것이다.
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