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문제 정의
- 이에 본인은 뇌부종과 뇌조직 염증반응에 미치는 石斛의 효능을 관찰하기 위하여 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 石斛 열수추출물을 3일간 경구 투여하였다. 이후 뇌조직출혈 부위의 크기와 뇌부종의 비율을 측정하고, 뇌출혈 주변부에서 MPO를 특징적으로 발현하는 중성백혈구의 침착과 iNOS 양성반응 세포의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 본인은 뇌부종과 뇌조직 염증반응에 미치는 石斛의 효능을 관찰하기 위하여 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 石斛 열수추출물을 3일간 경구 투여하였다. 이후 뇌조직출혈 부위의 크기와 뇌부종의 비율을 측정하고, 뇌출혈 주변부에서 MPO를 특징적으로 발현하는 중성백혈구의 침착과 iNOS 양성반응 세포의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 작게 자른 石斛 400 g에 3,000 ㎖의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 120.0 g의 추출물을 얻어 수율은 30.0% 였으며, 500 ㎎/㎏을 실험동물의 1회 투여량으로 하여 뇌조직출혈 유발 3시간 후부터 약 20시간 간격으로 총 3회 경구 투여 하였다.
- 실험에 의하면 뇌허혈이 생긴지 2시간 만에 내피세포 기저층의 퇴화가 시작되고 혈액뇌관문의 투과성이 급격하게 증가하였다고 보고되었다.29) 이에 뇌조직출혈 크기를 측정하기 위하여 흰쥐의 선조체내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 石斛 열수추출물을 3일간 경구 투여하였다. 그 후 뇌 절편 영상으로 ICH군과 ICH+DH군의 대뇌반구 뇌출혈 면적의 증가비율을 비교하여 관찰한 결과 뇌조직출혈 크기가 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군에서 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다.
- 그러므로 중성백혈구의 iNOS 발현이 질화(nitration)와 염소화(chlorination)를 촉진하며, NO의 최종산물인 NO2 이온이 염증부위에서 대식세포에 의한 산화의 반작용(oxidative reaction)에 중요한 역할을 한다.37)이러한 염증반응 기전을 참고하여 뇌조직출혈 주변부에 iNOS 발현의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군은 뇌조직출혈 부위에서 iNOS 발현 강도가 감소하였으며, 주변조직에서 iNOS 양성반응 세포 수가 유의하게 감소하였다.
- 36) 또한 중성백혈구는 MPO를 발현하며, MPO가 살균성 민감한 산화제(reactive oxidant)인 MPO-H2O2-Clsystem의 차아염소산(hypochlorous acid)과 차아염소산염(hypochlorite)를 생산하여 염증반응을 지속시키고 확장시킨다.7) 그러므로 뇌조직출혈 주변부에서 MPO에 양성반응을 보이는 중성백혈구를 면역형광염색으로 관찰하였다. 그 결과 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군에서는 뇌조직출혈 주변부에 침착된 중성백혈구의 수가 ICH군에 비해 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다.
- 石斛이 뇌조직출혈에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 흰쥐의 선조체에 콜라겐분해효소를 주입하여 출혈을 유발한 다음 石斛 열수추출물을 경구 투여하였다. 그 후 뇌출혈 크기와 뇌부종 비율의 변화를 관찰하였으며, 출혈 주변부에서 MPO 양성반응의 중성백혈구 침착과 iNOS 양성반응 세포의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색으로 관찰한 바 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 면역형광염색된 MPO 양성반응 세포는 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였으며, DAB로 발색된 iNOS발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학 현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software (ver.
- 石斛이 뇌조직출혈에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 흰쥐의 선조체에 콜라겐분해효소를 주입하여 출혈을 유발한 다음 石斛 열수추출물을 경구 투여하였다. 그 후 뇌출혈 크기와 뇌부종 비율의 변화를 관찰하였으며, 출혈 주변부에서 MPO 양성반응의 중성백혈구 침착과 iNOS 양성반응 세포의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색으로 관찰한 바 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 뇌조직출혈 유발 48시간 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 1 ㎜ 두께의 뇌절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 촬영한 다음 ImageJ software (ver.
- 뇌조직출혈 유발을 위한 수술과정은 electronic temperature controller (CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온 (37±0.5℃)이 유지되는 상태에서, 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas의 흡입마취 하에서 이루어졌으며, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium (50 ㎎/㎏)을 복강주사 하였다.
- 다음 0.05% 3,3′-diamino-benzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 2분간 발색시키고 수세하고 탈수한 다음 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- iNOS는 1차 항체를 anti-iNOS (1:200, #610297, BD Science, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody (1:200, Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어낸 후 avidin-biotin immuno-peroxidase의 방법에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 0.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.2 ㎜, 우측으로 3.5 ㎜ 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 ㎜ 직경의 두개골 천공을 만들고, 뇌정위고정장치에 장착된 Hamilton 주사기 (26-gauge, 10 ㎕, Hamilton, USA)를 뇌경막(dura mater)으로부터 5.5 ㎜ 깊이로 선조체에 삽입하였다. 이어서 1 ㎕ 내에 0.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
- 뇌조직출혈에 대한 石斛의 효능을 관찰하기 위하여 실험군은 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정을 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham군)과 두개골천공 후 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직출혈을 유발시킨 대조군 (ICH군) 및 대조군과 같이 뇌조직출혈을 유발한 다음 石斛 열수추출물을 경구투여한 石斛 투여군(ICH+DH군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 18마리씩 총 54마리를 사용하였다.
- 면역조직화학 및 면역형광 염색을 위해 뇌조직출혈 유발 48시간 후 실험동물을 pentobarbital의 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담궈 침전시켰다.
- 면역형광염색된 MPO 양성반응 세포는 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였으며, DAB로 발색된 iNOS발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학 현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다.
- 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software (ver. 1.41, NIH, USA)를 사용하여 뇌출혈 주변부에서 양성반응 세포 수를 측정한 다음일정면적 (105 ㎛2)으로 보정하여 자료로 사용하였다.
- 뇌조직출혈 유발 48시간 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 1 ㎜ 두께의 뇌절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 촬영한 다음 ImageJ software (ver. 1.41, NIH)를 사용하여 각 뇌절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구 (intact hemisphere)와 출혈측 대뇌반구 (hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다.
- 그러나 石斛이 허혈성 뇌경색(cerebral infarction)이나 뇌조직출혈(intracerebral hemorrhage, ICH)등 뇌질환의 임상증상의 예후판단에 중요한 뇌부종에 관한 연구는 없었다. 이에 治風劑로서 風痺를 治療를 치료하고, 강력한 신경세포 보호효과, 신경세포 독성을 차단하여 이차적인 신경손상을 억제하는 선행연구와 연관지어 石斛이 뇌출혈로 인한 염증반응과 뇌부종의 경감에 미치는 영향을 관찰하였다.
대상 데이터
- 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정을 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham군)과 두개골천공 후 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직출혈을 유발시킨 대조군 (ICH군) 및 대조군과 같이 뇌조직출혈을 유발한 다음 石斛 열수추출물을 경구투여한 石斛 투여군(ICH+DH군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 18마리씩 총 54마리를 사용하였다. Sham군의 조직은 염색과정 등에서 정상대조군으로 사용하였으며, 그 자료는 실험결과로 제시하지 않았다.
- 41, NIH)를 사용하여 각 뇌절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구 (intact hemisphere)와 출혈측 대뇌반구 (hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 다음 뇌를 -40℃의 dry ice-isophentane 용액으로 동결시키고 조직절편을 제작할 때까지는 -80℃에 보관하였다. 뇌조직은 cryocut으로 30 ㎛ 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 石斛 (Dendrobii Herba, DH)은 (주)허브메디에서 구입하였다. 작게 자른 石斛 400 g에 3,000 ㎖의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다.
- 실험동물은 나라바이오텍 (Nara Biotechnology, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도 (21-23℃), 습도(40-60%), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 이후 3회 씻어 낸 후 1차 항체를 처리하였다. 중성백혈구 표식자인 myeloperoxidase (MPO)에 대해서 1차 항체는 anti-MPO (1:250, A-0398, DAKO, USA)를, 2차 항체는 Cy5-conjugated goat anti-rabbit (1:200, ab6564, Abcam, UK)를 사용하였다. iNOS는 1차 항체를 anti-iNOS (1:200, #610297, BD Science, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다.
데이터처리
- 측정된 모든 자료는 student's t-test를 사용하여 ICH 군과 ICH+DH군 사이에서 P<0.05의 유의수준으로 검증하였다.
성능/효과
- 1) ICH로 인한 신경학적 손상은 물리적인 뇌조직의 직접손상, 세포독성에 의한 세포자연사(apoptosis)와 괴사(necrosis), 혈관성으로 생기는 뇌부종 및 염증반응 등을 들 수 있다.2,3) 특히 뇌부종은 ICH를 포함한 여러 뇌조직 손상에서 뇌혈관장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)의 손상과 뇌조직의 염증반응으로 인해 발생하는데,4,5)임상증상을 악화시키는 주요 인자일 뿐만 아니라 임상예후판단의 지표가 된다.
- 1. 石斛은 뇌출혈의 크기를 ICH군에 비해 유의하게 감소시켰다.
- 2. 石斛은 뇌부종 비율을 ICH군에 비해 유의하게 감소시켰다.
- 24,25) 혈액뇌관문은 뇌의 정상적인 기능과 항상성을 유지하는데 필수적인 작용을 하고 있으며, 모세혈관과 뇌조직 사이의 투과성이 낮은 막을 일컫는다.26) 뇌조직의 모세혈관은 혈관에 존재하는 수용성 물질과 500 dalton 이상의 크기를 가진 물질은 뇌조직으로 들어가기가 어려운 물리적 장벽을 유지하며, 신경세포의 적절한 기능수행을 위한 주변의 미세 환경을 유지하고 조절하는데 중요한 역할을 한다.27,28) 그러나 병리적인 상황에서는 혈액뇌관문이 비교적 빠른 시간에 파괴되어 신경세포 손상을 촉진한다.
- 3. 石斛은 뇌출혈 주변부에서 MPO 양성반응의 중성백혈구 침착을 ICH군에 비해 유의하게 감소시켰다.
- 4. 石斛은 뇌출혈 주변부에서 iNOS 양성반응 세포를 ICH군에 비해 유의하게 감소시켰다.
- 2,3) 특히 뇌부종은 ICH를 포함한 여러 뇌조직 손상에서 뇌혈관장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)의 손상과 뇌조직의 염증반응으로 인해 발생하는데,4,5)임상증상을 악화시키는 주요 인자일 뿐만 아니라 임상예후판단의 지표가 된다.6) 뇌조직의 출혈은 살균성과 반응이 빠른 산화제(reactive oxidant)인 MPO-H2O2-Cl-system의 차아염소산(hypochlorous acid)과 차아염소산염(hypochlorite)을 생산하여 염증반응을 지속시키고 확장시키는 MPO를 특징적으로 발현하는 중성백혈구의 침윤을 동반한다.7,8) 또 한 뇌조직의 출혈은 반응이 빠른 활성산소(reactive oxygen species), 단백질 분해 효소인 프로테아제(protease)와 같은 세포독성물질을 분비하여 뇌조직에 염증반응을 일으켜 이차적으로 BBB를 손상시키고 뇌조직손상을 악화시키는 요인이 된다.
- 7) 그러므로 뇌조직출혈 주변부에서 MPO에 양성반응을 보이는 중성백혈구를 면역형광염색으로 관찰하였다. 그 결과 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군에서는 뇌조직출혈 주변부에 침착된 중성백혈구의 수가 ICH군에 비해 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다.
- 37)이러한 염증반응 기전을 참고하여 뇌조직출혈 주변부에 iNOS 발현의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군은 뇌조직출혈 부위에서 iNOS 발현 강도가 감소하였으며, 주변조직에서 iNOS 양성반응 세포 수가 유의하게 감소하였다.
- 29) 이에 뇌조직출혈 크기를 측정하기 위하여 흰쥐의 선조체내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 石斛 열수추출물을 3일간 경구 투여하였다. 그 후 뇌 절편 영상으로 ICH군과 ICH+DH군의 대뇌반구 뇌출혈 면적의 증가비율을 비교하여 관찰한 결과 뇌조직출혈 크기가 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군에서 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다.
- 뇌출혈 흰쥐의 MPO 양성반응 중성백혈구 침윤에 미치는 영향을 측정한 결과, ICH군에 MPO 양성반응을 보이는 중성백혈구 침착 개수는 86.5±6.9 cell/105 ㎛2였으며, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군의 MPO 양성반응을 보이는 중성백혈구 침착 개수는 67.8±3.9 cell/105 ㎛2로 ICH군에 비해 유의한 감소(p<0.05)를 나타내었다 (Fig. 4).
- 뇌출혈 흰쥐의 뇌부종 비율을 측정한 결과, ICH군의 뇌부종 비율은 117.7±0.7% 였으며, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군의 뇌부종 비율은 114.9±0.8%로 ICH군에 비해 유의한 감소(p<0.05)를 나타내었다 (Fig. 2, 3).
- 뇌출혈 흰쥐의 뇌출혈 크기를 측정한 결과, ICH군의 출혈부위 크기는31.37±1.73 ㎜3였으며, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군은 23.25±2.41 ㎜3로 ICH군에 비해 유의하게(p<0.05) 감소하였다 (Fig. 1, 2).
- 뇌출혈 흰쥐의 혈종 주변부 iNOS 양성반응 세포에 미치는 영향을 측정한 결과, ICH군의 iNOS 양성반응 세포 수는 29.8±3.8 cell/105 ㎛2였으며, 石斛 열수추출물을 투여한 ICH+DH군의 iNOS 양성반응 세포 수는 18.7±2.2 cell/105 ㎛2로 ICH군에 비해 유의한 감소(p<0.05)를 나타내었다(Fig. 5).
- 이러한 결과들을 총괄하면, 石斛은 뇌조직출혈 주변조직에서 MPO 양성반응의 중성백혈구의 침윤을 억제하고, iNOS 발현을 억제하여 뇌조직 염증을 감소시켜 뇌출혈의 크기와 뇌부종을 감소시키는 것으로 판단된다.
- 이상의 결과들로 보아 石斛은 뇌출혈 부위에서 염증을 억제하여 뇌출혈 크기와 뇌부종을 감소시키는 것으로 판단된다.
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