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문제 정의
- 이 논문에서는 또한 射干 물 추출물이 cytokine 생성에도 영향을 주는지 알아보았다. 기존의 보고와 같이, LPS는 TNF-a,IL-1b, IL-6와 같은 전염증성 cytokine의 생성을 유도하였다6).
- 射干의 성분과 메탄올 추출물에 대한 보고는 있으나4), 射干의 물 추출물이 대식세포에서 항염증 작용을 나타내는 지에 대해서는 정확히 알려지지 않았다. 이에 우리는 射干의 물 추출물의 항염증 작용과 그 기전을 조사하였다.
- 이는 물 추출과 메탄올 추출의 유효성분이 다를 수 있음을 보여준다. 이에 이 논문에서는 射干의 물 추출물을 이용해 그 유효한 성분의 작용과 효과를 밝혀냈다.
제안 방법
- 24시간 동안 배양한 뒤, 세포 상층액 따서 96-well plate에 loading하였다. 100 ㎕의 그리스 시약을 첨가하고, 그 혼합물을 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 스펙트로포토메터 (MD, U.
- Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen(USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1beta, IL-6, TNF-alpha를 구입하여 시행하였다.
- 동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼 (4X)를 같이 넣어 섞은 다음 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 5% skim milk로 2 시간 blocking 하였다. ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 Ik-Ba을 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- LPS (500 ng/ml)로 RAW 264.7 cell을 자극하기 전 射干 추출물을 1시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- RAW 264.7 cell에서 전염증성 인자들의 발현에 射干 물 추출물의 효과를 조사하기 위하여, 射干를 전 처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1b, IL-6, TNF-a를 측정하였다. 전염증성 인자들의 발현을 조사한 결과 射干 물 추출물이 IL-1 beta의 생성은 억제하지 못하였으나, IL-6 와 TNF-a의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다
- 射干 물 추출물에서의 항염효과에 대해서 조사하기 위하여 먼저 射干가 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 射干를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다.
- 7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 射干를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 射干 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig.
- 射干의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 射干를 농도 의존적으로 처리하여 24 시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다. Fig.
- 7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수 성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 射干을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
- 현재 많은 항염증 약물이 많이 발견되었지만, 그 약효는 한정 되어있고, 이제 그 약물조차도 내성과 독성으로 인해 대안이 필요한 것이 현실이다. 그 대안으로 떠오르는 것이 천연물 신약이며, 이에 이 논문에서는 射干 물 추출물을 이용하여, 항염증 작용을 알아보았다. 射干은 한국과 일본 등지의 동남아시아에서 자라며, 중국에서는 다양한 염증질환을 치료하는 데 이용되고 있다21,22).
- 7 cell에서 NO와 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, TNF-a)의 발현에 대한 실험을 하였고, MAPKs family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 NF-kB의 활성 지표가 될 수 있는 inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다.
- 마우스 대식 세포 주인 RAW 264.7 cell을 LPS로 자극하였을 때 射干 물 추출물의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수 성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 射干을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
- 이에 射干 물 추출물이 LPS로 유도한 대식세포의 활성화를 억제하는 효과를 검증하고자 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7 cell에서 NO와 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, TNF-a)의 발현에 대한 실험을 하였고, MAPKs family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 NF-kB의 활성 지표가 될 수 있는 inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다.
- A)로 540 nm에서 측정하였다. 일산화질소의 농도는 아질산염의 표준커브로부터 계산하였다.
대상 데이터
- Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St.
- Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St. Louis, USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho-p38, anti-Ik-Ba, anti-phospho-JNK는 Cell signaling사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.
- 실험에 사용한 射干는 옴니허브에서 구입하여 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 射干로서 확인을 받은 후 사용하였다. 射干 추출물을 얻기 위하여 물 1 L에 射干 100 g을 넣고 2시간 30분 동안 전탕한 액을 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한 후 사용하였다
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± S.D. 로 나타내었으며, 실험결과에 대한 통계처리는 students' t-test에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- The cells were treated with BC water extract as indicated concentration for 1 h, and then incubated with or without 500 ng/ml LPS for 24 h. NO release was measured by the method of Griess. *P < 0.
- 7 cell을 자극하기 전 射干 추출물을 1시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen(USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1beta, IL-6, TNF-alpha를 구입하여 시행하였다.
- RAW 264.7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수 성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 射干을 처리하였다.
- 그리고 침전물에 DEPC 처리한 증류수를 15 ㎕씩 넣어 RNA를 용해시키고 정량한다. 추출한 RNA는 reverse transcriptase PCR 의 protocol을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 간단히 기술하자면 역전사 반응을 위하여 total RNA (1 mg) 에 0.
성능/효과
- 射干를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 射干 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig. 2).
- 射干 물 추출물은 세포독성이 거의 나타나지 않았으며 농도 의존적으로 NO 생산을 억제하였고, IL-6 와 TNF-a의 생성을 단백질 수준과 mRNA 수준에서 억제하였다. 射干 추출물은 JNK, p38의 활성을 억제하였으나, ERK 와 NF-kB 활성를 억제하지 못했다.
- 射干 물 추출물이 RAW 264.7 cell에서 전염증성 세포 활성 물질을 단백질 수준에서 억제하였음에 착안하여(Fig. 3), mRNA 수준에서도 전염증성 인자들을 억제함을 알아보기 위해 射干 물 추출물을 전 처리한 후 LPS로 자극하여 IL-1b, IL-6, TNF-a의 mRNA를 측정한 결과, IL-6 와 TNF-a mRNA 발현은 현저히 억제하였으나, IL-1b mRNA 발현은 억제하지 못했다(Fig. 4).
- 특히 이들 중에서 TNF-a와 IL-6는 염증성 질환 등에서도 주요한 작용을 하며, 실제로 패혈증과 같은 염증성 질환이 일어났을 때, 신체 내에서 고농도로 발현이 되고, 이는 장기로 유입되어서 장기 손상과 부전을 일으킨다고 보고되어있다26,27). 이 연구에서는 射干 물 추출물이 LPS로 유도한 TNF-a와 IL-6의 생성을 억제하였음 보여줬다. 이러한 결과로 보아 射干 물 추출물의 유효한 성분이 항염증 작용을 가지고 있음을 보여준다(Fig.
- 이와 같은 결과로 보아 射干 물 추출물은 대식세포에서 염증을 발생 하였을 때, NO 및 IL-6, TNF-a의 발현을 억제하고, 이는 JNK, p38 MAPKs의 활성를 억제함을 통해 일어남을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 射干 물 추출물에서도 유효한 성분이 작용하여 항염증 작용을 보여줌을 알 수 있었다.
- 이러한 결과로 보아 射干 물 추출물의 유효한 성분이 항염증 작용을 가지고 있음을 보여준다(Fig. 3 & 4).
- 이러한 실험 결과들은 射干 물 추출물이 대식세포에서 JNK와 p38 의 인산화를 저해하여서 IL-6, TNF-a와 NO의 생산을 억제하였다고 생각된다. 射干 물 추출물의 이와 같은 작용은 천식,류마티스 관절염 같은 자가 면역 질환과 소화 질환 염증, 예를 들어 췌장염, 지방간, 대장염 등과 염증에 효과적일 것이라고 생각되어진다.
- 이와 같은 결과로 보아 射干 물 추출물은 대식세포에서 염증을 발생 하였을 때, NO 및 IL-6, TNF-a의 발현을 억제하고, 이는 JNK, p38 MAPKs의 활성를 억제함을 통해 일어남을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 射干 물 추출물에서도 유효한 성분이 작용하여 항염증 작용을 보여줌을 알 수 있었다.
- 7 cell에서 전염증성 인자들의 발현에 射干 물 추출물의 효과를 조사하기 위하여, 射干를 전 처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1b, IL-6, TNF-a를 측정하였다. 전염증성 인자들의 발현을 조사한 결과 射干 물 추출물이 IL-1 beta의 생성은 억제하지 못하였으나, IL-6 와 TNF-a의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다
후속연구
- 射干 물 추출물의 이와 같은 작용은 천식,류마티스 관절염 같은 자가 면역 질환과 소화 질환 염증, 예를 들어 췌장염, 지방간, 대장염 등과 염증에 효과적일 것이라고 생각되어진다. 위와 같은 射干 물 추출물의 효능을 이용하여, 추가적인 마우스나 랫트에서 in vivo 실험이 이루어져야 할 것이다.
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