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문제 정의
- 이러한 자료들을 바탕으로 본 저자는 TXL이 고콜레스테롤혈증이 유발된 생쥐의 간 및 심장 조직에 지방 축적 정도 및 혈중 콜레스테롤 함량 변화에 미치는 영향을 관찰 하였다.
- 이에 저자는 TXL이 고지방식이 공여로 유발된 고콜레스테롤 혈증 생쥐의 간 및 심장 조직에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 4주간 고지방식이를 투여하여 고콜레스테롤증을 유발하고, 2주간 TXL을 투여하면서 체중변화를 관찰하고, 2주간의 TXL 투여가 끝난 후 간 및 심장조직을 적출하여 지방분포를 관찰하였다. 아울러, 혈액 내의 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량 변화를 관찰하였다.
가설 설정
- a) Typical analysis of cholesterol in lard = 0.95 mg/gram.
제안 방법
- 1주일간의 실험실 적응이 끝나고, 고지방식이를 공여하기 시작하는 날 전자저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 7일 간격으로 체중을 측정하였다. 총 6주간의 실험기간 동안 주 1회 식이량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다.
- 2주간의 약물 투여가 끝난 후, 생쥐의 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 얻어진 혈액을 5,000 x g로 20분간 원심분리하여 상청액을 취하여 혈중 콜레스테롤 및 triglyceride 함량을 측정하였다.
- 고정된 조직은 Paraffin 포매과정을 거쳐서 조직 절편을 완성하였다. 5 ㎛ 두께로 절제된 조직을 슬라이드 글라스 위에 올리고 haematoxylin and eosin 기법으로 염색하고, 광학 현미경 (Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- 6주간의 실험이 끝나고, 생쥐를 희생시킨 후, 간과 심장을 적출하였다. 간은 대엽의 첨부, 심장은 심실 부위를 절제하여 인산완충액에 헹군 후, 4% paraformaldehyde에 1일간 고정하였다.
- Body weights were measured on day which TXL was firstly administered (day 1) and every 7 days. Normal : naive Mice, CTL : Hypercholesterolemic Mice, TXL : TXL administered Mice.
- 실험 5주 째부터는 정상군은 계속 일반식이를 공급하면서, D/W를 1일 1회 구강투여 하였고, 고지혈증군대조군(CTL)은 고지방식이를 공여하면서 D/W를 1일 1회 구강투여하였다. TXL 투여군 (TXL)은 고지방 식이를 계속 공여하면서 TXL을 10 ㎎/day 농도로 구강투여 하였다. 쥐의 대사속도는 사람보다 10배 이상 빠르고, TXL의 적정 사용량은 1일 6 ~ 12 g임을 감안하여 사람의 1일 투여량의 대략 4배에 해당하는 값으로 투여용량을 결정하였다.
- 6주간의 실험이 끝나고, 생쥐를 희생시킨 후, 간과 심장을 적출하였다. 간은 대엽의 첨부, 심장은 심실 부위를 절제하여 인산완충액에 헹군 후, 4% paraformaldehyde에 1일간 고정하였다. 고정된 조직은 Paraffin 포매과정을 거쳐서 조직 절편을 완성하였다.
- 본 연구의 결과에서 6주간의 고지방식이 투여는 간 조직 내에 확연한 지방 축적의 흔적인 microsteatosis를 형성 하였다 (Fig. 2B). 이러한 지방 축적의 궁극적인 원인은 에너지 섭취와 소모의 불균형에서 오는 지질대사 이상이다18).
- 실험 시작 후 4주간은 정상식이군 (Normal)에는 일반 사료를 공급하였고, 고지방식이군 (CTL, TXL)에는 고지방식이를 공급하였다. 실험 5주 째부터는 정상군은 계속 일반식이를 공급하면서, D/W를 1일 1회 구강투여 하였고, 고지혈증군대조군(CTL)은 고지방식이를 공여하면서 D/W를 1일 1회 구강투여하였다. TXL 투여군 (TXL)은 고지방 식이를 계속 공여하면서 TXL을 10 ㎎/day 농도로 구강투여 하였다.
- 실험 시작 후 4주간은 정상식이군 (Normal)에는 일반 사료를 공급하였고, 고지방식이군 (CTL, TXL)에는 고지방식이를 공급하였다. 실험 5주 째부터는 정상군은 계속 일반식이를 공급하면서, D/W를 1일 1회 구강투여 하였고, 고지혈증군대조군(CTL)은 고지방식이를 공여하면서 D/W를 1일 1회 구강투여하였다.
- 이에 저자는 TXL이 고지방식이 공여로 유발된 고콜레스테롤 혈증 생쥐의 간 및 심장 조직에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 4주간 고지방식이를 투여하여 고콜레스테롤증을 유발하고, 2주간 TXL을 투여하면서 체중변화를 관찰하고, 2주간의 TXL 투여가 끝난 후 간 및 심장조직을 적출하여 지방분포를 관찰하였다. 아울러, 혈액 내의 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량 변화를 관찰하였다.
- 2주간의 약물 투여가 끝난 후, 생쥐의 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 얻어진 혈액을 5,000 x g로 20분간 원심분리하여 상청액을 취하여 혈중 콜레스테롤 및 triglyceride 함량을 측정하였다. 혈청 중 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 및 Triglyceride의 함량은 각각의 측정용킷(아산제약, 한국)을 사용하였으며, OD (Optical Density)값은 분광광도계 (Hitachi, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- TXL 투여군 (TXL)은 고지방 식이를 계속 공여하면서 TXL을 10 ㎎/day 농도로 구강투여 하였다. 쥐의 대사속도는 사람보다 10배 이상 빠르고, TXL의 적정 사용량은 1일 6 ~ 12 g임을 감안하여 사람의 1일 투여량의 대략 4배에 해당하는 값으로 투여용량을 결정하였다. 실험 식이는 두열바이오텍(대전, 한국)에 주문 제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1와 같다.
- 1주일간의 실험실 적응이 끝나고, 고지방식이를 공여하기 시작하는 날 전자저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 7일 간격으로 체중을 측정하였다. 총 6주간의 실험기간 동안 주 1회 식이량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다. 측정단위는 24시간으로 전일 오후 6시에 고형사료와 음용수를 공여한 후, 다음 날 오후 6시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다.
- 총 6주간의 실험기간 동안 주 1회 식이량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다. 측정단위는 24시간으로 전일 오후 6시에 고형사료와 음용수를 공여한 후, 다음 날 오후 6시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 식이량 및 음수량으로 계산하였다.
- 얻어진 혈액을 5,000 x g로 20분간 원심분리하여 상청액을 취하여 혈중 콜레스테롤 및 triglyceride 함량을 측정하였다. 혈청 중 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 및 Triglyceride의 함량은 각각의 측정용킷(아산제약, 한국)을 사용하였으며, OD (Optical Density)값은 분광광도계 (Hitachi, Japan)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 고지혈증 유발을 위하여 체중 18 ~ 20 g의 웅성 C57BL6 (두열바이오텍, 한국)을 사용하였다. 실험 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 dark/light)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 쥐의 대사속도는 사람보다 10배 이상 빠르고, TXL의 적정 사용량은 1일 6 ~ 12 g임을 감안하여 사람의 1일 투여량의 대략 4배에 해당하는 값으로 투여용량을 결정하였다. 실험 식이는 두열바이오텍(대전, 한국)에 주문 제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1와 같다.
- 통심락 (通心絡, Tong Xin Luo, TXL)은 대신제약 (충북, 한국)에서 수입하고 일양약품 (경기, 한국)에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
성능/효과
- 6주간의 실험기간 동안 식이량 및 음수량의 변화를 관찰한 결과 CTL군과 TXL군 모두에서 NOR군에 비하여 유의한 식이량 및 음수량 감소 현상이 관찰 되었다 (Table 2). CTL군과 TXL군 사이에 식이량 및 음수량의 특별한 차이는 관찰되지 않았다 (Table 2).
- . 6주간의 실험기간 동안 식이량과 음수량 변화를 살펴본 결과 CTL군과 TXL군이 NOR군에 비하여 유의한 수준의 식이량 및 음수량 감소현상이 나타났다 (Table 2). 이는 고콜레스테롤혈증의 유발이나 기타 생체 내적 요인에 기인하는 것이 아니라 고지방식이 자체의 문제에 기인한다고 생각된다.
- 6주간의 실험이 끝난 후, 간조직을 적출하여 지방 분포를 관찰한 결과 CTL군에서 NOR군에 비하여 확연히 증가된 지방 분포를 관찰할 수 있었다 (Filled arrow). TXL군에서는 고콜레스테롤 혈증 유발에 의하여 증가하는 지방 분포를 감소시키는 경향을 보였다 (Fig.
- 6주간의 실험이 끝난 후, 심장 조직을 적출하여 관찰한 결과 모든 군에서 특별한 차이를 발견할 수 없었다 (Fig. 3).
- TXL을 투여하기 시작한 후 체중 변화는 실험 5주차와 6주차에서 살펴 볼 수 있다. 6주차의 체중은 TXL 투여 전인 4주차 체중을 기준으로 NOR군은 1.1% 증가하였고, CTL군은 2.2% 증가한 반면, TXL군은 0.4% 증가에 그쳤다 (Fig. 1). 이는 TXL의 투여가 고콜레스테롤혈증에서 보이는 점진적인 체중 증가를 억제하는 경향을 보이는 것으로 해석될 수 있다.
- 4D). LDL cholesterol 은 고콜레스테롤 혈증 유발에 의하여 유의한 수준으로 함량이 증가함이 관찰되었으며, TXL군은 CTL군에 비하여 LDL cholesterol 함량이 감소하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다 (Fig. 4B). HDL cholesterol은 모든 군에서 특별한 차이를 발견할 수 없었다 (Fig.
- 고콜레스테롤혈증 생쥐 모델에서 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향 및 기전을 실험적으로 규명하기 위하여 고지방식이를 투여하여 고콜레스테롤혈증을 유발하고, 2주간 通心絡을 투여한 다음 간과 심장 조직을 적출하여 조직병리학적 이상변화를 관찰하고 혈액으로부터 total cholesterol, HDL -cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량변화를 관찰한 결과 通心絡은 고콜레스테롤증이 유발된 생쥐의 체중 증가량에 특별한 영향을 미치지 않았으며, 간 조직 내의 지방 축적을 억제하는 경향을 보였다. 또한, 고콜레스테롤증이 유발에 의하여 상승된 혈중 total cholesterol 및 triglyceride 함량을 유의한 수준으로 낮추었다.
- 고콜레스테롤혈증 생쥐 모델에서 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향 및 기전을 실험적으로 규명하기 위하여 고지방식이를 투여하여 고콜레스테롤혈증을 유발하고, 2주간 通心絡을 투여한 다음 간과 심장 조직을 적출하여 조직병리학적 이상변화를 관찰하고 혈액으로부터 total cholesterol, HDL -cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량변화를 관찰한 결과 通心絡은 고콜레스테롤증이 유발된 생쥐의 체중 증가량에 특별한 영향을 미치지 않았으며, 간 조직 내의 지방 축적을 억제하는 경향을 보였다. 또한, 고콜레스테롤증이 유발에 의하여 상승된 혈중 total cholesterol 및 triglyceride 함량을 유의한 수준으로 낮추었다. 이러한 결과들을 통하여 通心絡은 이상지질혈증 개선을 통하여 간 내의 지방 축적을 억제 해준다는 사실을 알 수 있었다.
- 이는 고콜레스테롤혈증의 유발이나 기타 생체 내적 요인에 기인하는 것이 아니라 고지방식이 자체의 문제에 기인한다고 생각된다. 본 연구에서 사용된 고지방식이는 일반사료에 비하여 칼로리가 높고 (5.24 kcal/g) 습윤하고 부드러우며 밀도가 높다.
- 본 연구의 결과에서 6주간의 고지방식이의 공여를 통해 간 조직 내에 지방 축적의 흔적이 보이고, 혈중 total cholesterol과 trigliceride가 정상식이군에 비해 유의한 증가를 보이는 고콜레스테롤혈증이 유발되었다.
- 본 연구의 결과에서 체중 증가량의 감소세는 관찰되었으나 통계적으로 유의하지 않았고 (Fig. 1), 심장 조직에 특별한 영향을 미치지 못한 것 (Fig. 3)은 상대적으로 짧은 고콜레스테롤혈증 유발기간 (4주)과 TXL 투여기간 (2주)에 기인하는 것으로 생각된다. 추후 비교적 장기적인 실험 계획을 가지는 후속 연구를 통하여 TXL이 체중 변화에 미치는 영향과 각종 장기의 지방 축적 또는 기타 조직병리학적 이상변화 현상에 미치는 영향을 다각적으로 관찰해야할 필요성이 있다고 생각한다.
- 생쥐의 혈액으로부터 total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol 및 triglyceride 함량 변화를 관찰한 결과 total cholesterol은 CTL군에서 154.21±11.59 ㎎/㎗로 나타나 93.94±12.01 ㎎/㎗를 보인 NOR군에 비해 유의한 증가를 보였고, TXL군에서는 127.27±11.86 ㎎/㎗로 나타나 CTL군에 비하여 유의한 감소를 보였다 (Fig. 4A).
- 생쥐의 혈액으로부터 triglyceride 함량 변화를 관찰한 결과 CTL군에서 83.41±3.11 ㎎/㎗로 나타나 66.17±8.52 ㎎/㎗를 보인 NOR군에 비해 유의한 증가를 보였고, TXL군은 69.32±6.60 ㎎/㎗로 나타나 CTL군에 비하여 유의한 감소를 보였다 (Fig. 4D).
- 1). 약물이 투여되는 2주간의 체중 변화를 관찰한 결과 CTL군에서 보이는 체중 증가현상이 TXL 군에서 억제되는 경향을 보였으나 유의성은 없었다 (Fig. 1).
- 또한, 지방 축적의 원인은 궁극적으로 지질 대사 이상18)이므로 TXL이 지질대사 이상을 개선함으로써 간 내 지방 축적을 억제 하였다는 사실을 유추 할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 혈액 내의 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량에 미치는 영향을 조사한 결과 고콜레스테롤혈증 유발에 의하여 total cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량이 유의하게 증가되어 전형적인 고콜레스테롤혈증이 유발되었고 (Fig. 4), TXL의 투여는 total cholesterol과 triglyceride 함량을 유의한 수준으로 낮추었다 (Fig. 4A,D). 이러한 결과는 선행 연구결과3)와 일맥상통하며, TXL의 간 내 지방 축적 억제의 기전이 이상지질혈증의 개선에 있음을 시사한다.
- 체중 변화에 대한 결과를 살펴보면, 첫 4주간은 고콜레스테롤혈증 유발 단계로서 3주차부터 CTL군 및 TXL군은 유의한 수준으로 NOR군과 체중차가 나기 시작하였다 (Fig. 1). TXL을 투여하기 시작한 후 체중 변화는 실험 5주차와 6주차에서 살펴 볼 수 있다.
후속연구
- 이는 TXL의 투여가 고콜레스테롤혈증에서 보이는 점진적인 체중 증가를 억제하는 경향을 보이는 것으로 해석될 수 있다. 비교적 투여기간을 설정한 후속 연구를 통해 체중 증가를 억제하는 경향성에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다.
- 3)은 상대적으로 짧은 고콜레스테롤혈증 유발기간 (4주)과 TXL 투여기간 (2주)에 기인하는 것으로 생각된다. 추후 비교적 장기적인 실험 계획을 가지는 후속 연구를 통하여 TXL이 체중 변화에 미치는 영향과 각종 장기의 지방 축적 또는 기타 조직병리학적 이상변화 현상에 미치는 영향을 다각적으로 관찰해야할 필요성이 있다고 생각한다.
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