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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리나라 무스카리 우점품종인 ‘Early Giant’의 대량증식을 위한 선행연구로서 고빈도 체세포배발생 체계를 구축하기 위하여 잎 절편으로부터 캘러스 유도와 증식에 적합한 식물생장조절제를 선발하는 한편 캘러스 기원별로 체세포배 발생능을 검증하였다.
- 수요가 증가하고 있는 단자엽 구근 화훼작물인 무스카리 (Muscari armeniacum Leichtl. Ex Bak.) ‘Early Giant‘ 품종의 캘러스를 재료로 체세포배발생을 통한 기내 대량증식 체계를 확립하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 개화기에 도달한 무스카리 (M. armeniacum) ‘Early Giant’품종의 잎 (10∼12 cm)을 채취하여 흐르는 수돗물로 세척하고 증류수로 헹군 후 70% 에탄올에 약 10초간 침지 하였다.
- 1997; Suzuki and Nakano 2001). 따라서 본 연구에서는 캘러스의 체세포배 발생 유도 배지 이식 후 10주경부터캘러스 표면에서 발생되는 체세포배를 추적 관찰함으로써 체세포배 발생을 총 9단계로 구분하였다 (Fig. 3A~3I). 무스카리 체세포성 구형배 (Fig.
- armeniacum) ‘Early Giant’품종의 잎 (10∼12 cm)을 채취하여 흐르는 수돗물로 세척하고 증류수로 헹군 후 70% 에탄올에 약 10초간 침지 하였다. 멸균 증류수로 다시 2회 세척한 후 1% NaOCl 용액에서 15분간 교반하며 살균하였다. 처리된 잎을 멸균 증류수로 3회 세척한 후 멸균 건조된 여과지에서 물기를 제거하였다.
- 무스카리 ‘Early Giant’ 품종의 잎 절편 배양에서 캘러스 유기율이 높고 동일한 배지로 이식하였을 때 생장 역시 양호했던 10종의 캘러스 (Table 1. 캘러스 기호 A~J)를 구분하여 식물생장조절제 무첨가, NAA 0.01 mg･L-1와 BAP, kinetin 및 TDZ를 각각 0.1, 0.5, 1.0 mg･L-1 농도로 혼용 첨가한 총 10종의 배지로 이식 (총 100처리)하였다.
- 캘러스는 직경 5∼6 mm 크기로 만들어 페트리접시당 다섯개씩 치상하였으며 처리당 3개 반복을 이용하였고 배양환경은 캘러스 유도시와 동일하게 하였다. 배양 14주 후 동일조성의 액체 배지를 각 페트리접시에 3mL씩 보충하였으며 배양 20주 후에 발생한 체세포배의 수를 조사하였다. 유도된 체세포배는 생장단계에 따라 구형, 편심장형, 편어뢰형, 초기자엽형, 중기자엽형, 후기자엽형, 초기맹아형, 중기맹아형 및 후기맹아형 등 9단계 (Fig.
- 배양은 온도 25℃, 광도 50 µmol･m-2･s-1 하에서 16시간 일장조건으로 실시하였다. 배양 8주 후 캘러스 형성 율을 조사하였으며 형성된 캘러스 만을 취하여 동일한 조성의 배지로 이식하였다. 이식 6주 후 캘러스의 생장정도를 조사하였다.
- 배지의 pH는 멸균 전에 5.6으로 조정하였으며 멸균된 배지 25 mL를 60 × 15 mm 페트리접시에 분주하여 굳힌후 접시당 5개 절편을 치상하였고 처리당 6 반복으로 하였다.
- 살균된 잎은 가로로 7∼8 mm 크기로 자른후 중륵 부위에 약간의 상처를 내었으며, 잎 뒷면이 위로 향하도록 무작위로 각각의 배지에 치상하였다.
- 배양 14주 후 동일조성의 액체 배지를 각 페트리접시에 3mL씩 보충하였으며 배양 20주 후에 발생한 체세포배의 수를 조사하였다. 유도된 체세포배는 생장단계에 따라 구형, 편심장형, 편어뢰형, 초기자엽형, 중기자엽형, 후기자엽형, 초기맹아형, 중기맹아형 및 후기맹아형 등 9단계 (Fig. 3)로 구분하였다. 제1엽이 생장하고 유근이 신장한 체세포배는 상토를 채운 32공 플러그에 이식한 후 플라스틱 필름으로 덮어 습도를 유지하면서 생육시켰으며, 생육이 진행됨에 따라 상대습도를 점진적으로 낮추면서 기외 순화시켰다.
- 배양 8주 후 캘러스 형성 율을 조사하였으며 형성된 캘러스 만을 취하여 동일한 조성의 배지로 이식하였다. 이식 6주 후 캘러스의 생장정도를 조사하였다.
- 절편 배양 8주 후 모조직을 제외한 캘러스 만을 동일한 조성의 배지로 이식하여 지속생장을 도모하였고 캘러스 이식 6주 후에 그 생장 정도를 조사하였다. NAA와 IPA 첨가배지에서 연속적으로 배양된 캘러스는 그 생장이 빈약했던 반면, 2,4-D, picloram 및 dicamba를 첨가한 배지에서 유도하고 생장한 캘러스는 2,4-D 0.
- 절편으로부터 캘러스 발생율이 높고 증식 또한 양호 했던 배지에서 유래된 10종의 캘러스 (Table 1. 캘러스 기호 A~J)를 1/2 MS를 기본배지로 하고 식물생장조절제 무 첨가, NAA 0.01 mg･L-1와 N6-benzylaminopurine (BAP), 6-Furfurylaminopurine (kinetin) 및 N-phenyl-N1-1,2,3,-thiadiazol5-ylurea (TDZ)를 각각 0.1, 0.5, 1.0 mg･L-1 농도로 혼용 첨가한 총 10종의 배지에 배양하였다. 캘러스는 직경 5∼6 mm 크기로 만들어 페트리접시당 다섯개씩 치상하였으며 처리당 3개 반복을 이용하였고 배양환경은 캘러스 유도시와 동일하게 하였다.
- 살균된 잎은 가로로 7∼8 mm 크기로 자른후 중륵 부위에 약간의 상처를 내었으며, 잎 뒷면이 위로 향하도록 무작위로 각각의 배지에 치상하였다. 캘러스 유도를 위한 배지는 1/2 Murashige와 Skoog (MS)(1962) 기본배지에 오옥신류인 1-naphthalene acetic acid (NAA), indole3-propionic acid (IPA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 4-amino-3,5,6-tri-chloropicolinic acid (picloram) 및 3,6-dichloroo-anisic acid (dicamba)를 0.1, 1.0, 2.0, 3.0 mg･L-1가 되도록 농도를 달리하여 각각 첨가하는 한편 자당 30 g･L-1와 한천 8 g･L-1를 모든 배지에 동일하게 첨가하여 조제하였다. 배지의 pH는 멸균 전에 5.
- 캘러스는 직경 5∼6 mm 크기로 만들어 페트리접시당 다섯개씩 치상하였으며 처리당 3개 반복을 이용하였고 배양환경은 캘러스 유도시와 동일하게 하였다.
성능/효과
- 3개의 체세포배를 획득할 수 있었다. 또한 무스카리 체세포배는 구형, 편심장형, 편어뢰형, 초기 자엽형, 중기 자엽형, 후기 자엽형, 초기 맹아형, 중기 맹아형 및 후기 맹아형배 등 총 9단계로 그 외형이 뚜렷이 구분되 었다.
- 5개/캘러스 덩어리)로 체세포배가 유기되었다. 또한 캘러스 기원과는 무관하게 TDZ 첨가배지에서의 체세포배 발생율은 극히 저조 (0.0~1.2개/캘러스 덩어리)하였는데 이는 동일 농도에서 다른 시토키닌류에 비해 TDZ가 지나치게 높은 활성을 가짐으로써 체세포배 발생이 억제된 결과로 사료된다. 따라서금 후 낮은 농도 수준에서 체세포배 발생에 미치는 TDZ 의 효과가 검토되어야 할 것으로 판단된다.
- 무스카리 ‘Blue Pearl’의 경우는 NAA 첨가배지에만 유일하게 배발생능이 양호한 WF 캘러스가 획득되어 (Suzuki and Nakano 2001) 본 실험 결과와는 차이를 보였는데, 본 실험에서는 NAA 보다 오히려 2,4-D, picloram 및 dicamba 처리가 WF 캘러스 획득에 효과적이었다.
- 무스카리 ‘Early Giant’ 잎 절편을 NAA, IPA, 2,4-D, picloram 및 dicamba 등 오옥신의 종류와 농도(0.1∼3.0 mg･L-1)를 달리한 총 21종의 배지에 치상하고 8주 후 캘러스 발생 율를 조사한 결과 식물생장조절제 무첨가 배지를 제외하고는 근소한 차이가 있기는 했지만 모든 배지에서 85%이상 높은 빈도로 부드러운 연녹색의 캘러스가 유기되었다 (Table 1, Fig. 1A).
- 무스카리 ‘Early Giant’를 식물재료로 이용하고 IPA와 dicamba를 추가한 본 실험에서도 언급한 ‘Blue Pearl’의 실험결과와 유사하게 최소 86.7%의 빈도로 캘러스가 유기되었다 (Table 1).
- 01 mg･L-1가 혼용된 배지에서 체세포배가 유기되었다. 무스카리 잎 절편을 picloram 0.1 mg･L-1 배지에 치상하여 캘러스를 유기하고 동일한 배지로 이식하여 증식한 후 NAA 0.01 mg･L-1와 BAP 0.5 mg･L-1 혼용배지로 이식했을 때 최고빈도인 캘러스 덩어리당 9.3개의 체세포배를 획득할 수 있었다. 또한 무스카리 체세포배는 구형, 편심장형, 편어뢰형, 초기 자엽형, 중기 자엽형, 후기 자엽형, 초기 맹아형, 중기 맹아형 및 후기 맹아형배 등 총 9단계로 그 외형이 뚜렷이 구분되 었다.
- 1C). 배양 20주 후 최종적으로 체세포배 발생율을 조사하였는데 (Fig. 2) 고농도 (1.0, 2.0, 3.0 mg･L-1)의 picloram 첨가배지에서 유기 및 생장한 캘러스 (기호 E, F, G)는 모든 배지에서 극히 저조한 빈도로 체세포배가 발생 (0.0~1.5개/캘러스 덩어리)한 반면 저농도 (0.1 mg･L-1) picloram 첨가배지 유래 캘러스 (기호 D)는 TDZ 첨가배지를 제외하고는 상당한 빈도(4.5~9.5개/캘러스 덩어리)로 체세포배가 유기되었다. 또한 캘러스 기원과는 무관하게 TDZ 첨가배지에서의 체세포배 발생율은 극히 저조 (0.
- 또한 유근의 분화는 대부분 맹아가 뚜렷해지는 시점부터 관찰되었다. 본 연구에서 관찰하고 구분한 무스카리 체세포배의 발달단계는 기 보고된 어뢰 형배까지의 해부학적 관찰 결과 (Suzuki and Nakano 2001) 와 일치하는 것이고, 자엽형 체세포배와 맹아형 체세포 배까지를 포함하여 일련의 체세포배 발달단계를 보다 세분화하여 제시하였다는데 의미가 있을 것으로 사료된다. 한편, 기내에서 유근이 완전히 생장한 맹아형 배는 한천을 완전히 제거한 후 상토가 담긴 플러그 트레이로 이식하고 충분히 관수하였다.
- 본 연구에서는 무스카리 ‘Early Giant’ 품종의 잎 절편을 picloram 0.1 mg･L-1 첨가배지에서 배양하여 캘러스를 유도하고 증식한 후 BAP 0.5~1.0 mg･L-1 첨가배지로 이식하였을 경우 캘러스 덩어리당 8.4~9.3개의 높은 빈도로 체세포배를 획득할 수 있 었다.
후속연구
- 2개/캘러스 덩어리)하였는데 이는 동일 농도에서 다른 시토키닌류에 비해 TDZ가 지나치게 높은 활성을 가짐으로써 체세포배 발생이 억제된 결과로 사료된다. 따라서금 후 낮은 농도 수준에서 체세포배 발생에 미치는 TDZ 의 효과가 검토되어야 할 것으로 판단된다. 무스카리 ‘Blue Pearl’의 잎 절편에서 유래된 WF캘러스의 경우는 BAP 첨가 배지로 이식하였을 때 식물생장조절제 무첨가 배지에 비해 심하게 체세포배 발생이 억제되는 (Suzuki and Nakano 2001) 반면, 본 연구에서의 BAP는 캘러스 기원에 따라 체세포배 발생에 미치는 효과에 다양한 변이를 보였다.
- 무스카리 ‘Blue Pearl’ (Suzuki and Nakano 2001) 과 본 연구의 ‘Early Giant’의 경우도 마찬가지로 picloram 이 2,4-D에 비해 잎 절편으로부터 캘러스 유기 또는 다음 실험에서 보여주는 바와 같이 캘러스의 연속적 생장에 효과적인데 (Table 1), 이러한 picloram의 효과가 M. armeniacum 종에 일반적인 현상인지는 다양한 유전자형을 대상으로 검토가 필요할 것으로 사료된다.
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