[논문]작물 단백질체 분석을 위한 이차원 전기영동 사용법

김유지; 정화진; 이수지; 김선태

doi:10.5010/jpb.2012.39.1.081

초록
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단백질체학에서 이차원 전기영동 (2-DGE)은 고해상도 단백질 분리가 가능한 중요 기술 중 하나이다. 본 논문에서는 2-DGE 이미지 분석 일치도를 향상시킴으로써 작물 단백질 검출과 정량분석이 가능하도록 하는 전반적인 주요 장비, 시약 등을 자세히 기술한 프로토콜을 제시하고 있다. 이 프로토콜은 식물의 발달, 생물학적, 비생물학적 스트레스 반응 등과 관련된 작물 단백질 바이오마커를 개발하기 위한 목적에서 2-DGE를 처음 시도하는 연구자들에게 유용할 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Two-dimensional gel electrophoresis (2-DGE) is one of the most important technologies for high-resolution separation of proteins for proteomics. In this study, we present a detail 2-DGE protocol which allows detection and quantification of total plant proteins separated on gels to improve matching i...

Two-dimensional gel electrophoresis (2-DGE) is one of the most important technologies for high-resolution separation of proteins for proteomics. In this study, we present a detail 2-DGE protocol which allows detection and quantification of total plant proteins separated on gels to improve matching in image analysis. This protocol highlighted here may be useful for researchers, who like to first study for the development of protein biomarkers involved in development, biotic and abiotic stresses in plant.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Table 1에서 많은 단백질 추출 방법이 소개되었으나, 본 논문에서는 식물 단백질 추출에 보편적으로 사용되는 phenol을 이용한 추출법을 설명하고자 한다.
단백질체학에서 이차원 전기영동 (2-DGE)은 고해상도 단백질 분리가 가능한 중요 기술 중 하나이다. 본 논문에서는 2-DGE 이미지 분석 일치도를 향상시킴으로써 작물단백질 검출과 정량분석이 가능하도록 하는 전반적인 주요 장비, 시약 등을 자세히 기술한 프로토콜을 제시하고있다. 이 프로토콜은 식물의 발달, 생물학적, 비생물학적스트레스 반응 등과 관련된 작물 단백질 바이오마커를 개발하기 위한 목적에서 2-DGE를 처음 시도하는 연구자들에게 유용할 것으로 기대한다.
본 논문에서는 2-DGE를 수행하는 데 있어 중요 개념을 이해하고 시약의 성분과 조성, 실험에 있어 중요하고 도움이 되는 노하우와 단백질 추출 방법을 자세히 기재함으로써 처음으로 2-DGE을 이용한 단백질체 분석을 원하는 연구자들에게 좋은 정보가 될 것으로 기대한다.
비록 IPGs 등과 같은 많은 기술적 측면들이 향상되었으나 2-DGE 자체가 자동화 될 수 없다는 문제점은 노동력이 많이 소모되고 실험자에 의하여 다양한 변수가 존재한다는 것을 의미하기도 한다. 이 논문에서는 2-DGE 에이용되는 시약들의 조성과 본 연구진의 실험실에서 사용하고 있는 중요한 노하우를 포함하는 상세한 2-DGE 분석기술을 소개함으로써 식물 단백질체 분석에 도움이 되는 프로토콜을 제시하고자 하였다.

제안 방법

Figure 6는 본 논문의 프로토콜로 수행한 작물별 2-DE 실험 결과로, 순번대로 고구마 잎 (1), 담배 잎 (2), 콩 잎 (3), 감자 뿌리 (4), 수수 종자 (5), 콩 종자 (6) 이다. 단백질spot 개수는 image master 2D Platinum sofrware 6.0 (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA)을 이용하여 측정하였으며, 각각의 단백질 spot 개수는 978 (1), 1404 (2), 1002 (3), 743 (4), 870 (5), 632 (6) 개의 높은 해상력을 가진 2-DGE 결과물을 얻었다.
따라서 본 연구진에서 수행하는 2-DGE 실험 일정을 figure 5에 제시하였다. 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 분석 한 날을 기준으로, 추출된 단백질의 상태와 양을 확인하고 당일날 단백질 정량 후, strip을 rehydration 시킨다. 둘째 날 오전, focusing을 하루에 걸쳐 수행하며 이는 타 논문의 프로토콜과 가장 큰 차이를 보이는 부분이다.
유리판 사이에 butanol을 마이크로 피펫을 사용하여 200 μl씩 두차례 분주하여 mixture 상층부를 평탄화한다.
추출된 단백질은 2-DE Quant Kit (Table 2 참조)를 이용하여 정량 분석하였다. Table 5에 기재된 Kit사용법을 상세히 설명하자면, 먼저 80% acetone에 보관된 단백질을 필요한 양만큼 microcentrifuge tube에 옮기고 원심 분리하여 아세톤을 완전히 제거한 후, rehydration buffer (Table 4 참고)에 녹인다.

대상 데이터

고구마, 콩 , 담배의 경우, 22℃, 70% 상대습도에서16시간의 광 조건으로 배양실에서 종자를 파종하여 키운 어린 잎을 사용하였다.
본 논문에 사용된 콩 종자와 수수 종자는 농촌진흥청 기능성작물부, 감자 뿌리는 국립농업과학원으로부터 분양받았다. 고구마, 콩 , 담배의 경우, 22℃, 70% 상대습도에서16시간의 광 조건으로 배양실에서 종자를 파종하여 키운 어린 잎을 사용하였다.

이론/모형

단백질 추출 시약을 사용하지 않고 곧바로 TCA나 acetone 침전을 하는 경우가 있는 반면, Tris-HCl, KCl, glycerol, protease inhibitor, DTT, Urea, thiourea 등의 조합을 이용한 단백질 추출 시약을 사용하거나, buffer-saturated phenol추출법을 이용한 경우 등 다양한 방법으로 단백질을 추출하였다. 본 논문에는Table 1에 주로 이용되는 단백질 추출 시약 조성과는 달리 본 연구진이 자체 개발한 MgNP-40 단백질 추출 용액 (Kim et al. 2001) 으로 비교적 간단한 조성의 추출시약을 사용하였다. 현재 MgNP-40 단백질 추출 시약을 이용한국제 수준의 논문들이 다수 투고되고 있는 것으로 보아 해당 추출 시약에 대한 인지도가 높아지고 있다는 것을 알 수 있다 (Agrawal et al.
본 논문에서는 Coomassie brilliant blue staining법을 이용하였다. SDS-PAGE가 끝나기 전 staining buffer (Table 4 참고)를 미리 만들어 두며, 전기영동이 완료되면 유리판을 분리, plate에 붙어있는 gel에서 strip 바깥 부분의 양 끝gel 영역을 칼로 잘라내어 쉽게 찢어지는 것을 방지하고, gel 아랫부분을 poly-glove를 낀 양 손으로 잡아 천천히 떼어낸다.

성능/효과

2-DGE 기술을 기반으로 한 식물 단백질 추출 방법에 관한 몇 가지 논문들을 비교 분석 한 결과 (Table 1), 단백질 추출 시약, 침전 방법, rehydration buffer 등에서 비슷한 시약들을 사용하나 조성이 조금씩 달랐다.

후속연구

본 논문에서는 2-DGE 이미지 분석 일치도를 향상시킴으로써 작물단백질 검출과 정량분석이 가능하도록 하는 전반적인 주요 장비, 시약 등을 자세히 기술한 프로토콜을 제시하고있다. 이 프로토콜은 식물의 발달, 생물학적, 비생물학적스트레스 반응 등과 관련된 작물 단백질 바이오마커를 개발하기 위한 목적에서 2-DGE를 처음 시도하는 연구자들에게 유용할 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	2-DGE기술은 무엇인가?	2-DGE기술은 단백질체학의 시작과 발전을 함께 하였다. 2-DGE 는 단백질간 패턴을 비교하여 단백질을 동정할 수 있는 기술이며 다양한 세포 상태에서 단백질 발현 변화와 관심 단백질의 특성에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 단백질체학적 접근법은 의학, 생물학, 생화학, 약학 조사 등의 다양한 주제들에 대한 연구에 상당히 중요한 역할을 수행하여 왔다 (Wittmann‐Liebold et al.
	단백질체학은?	단백질체학은 세포 생리에 직접적으로 영향을 주는 단백질들의 질적･양적 변화와 생장･발달･환경요인에 반응하는 동안의 세포 상태 및 기작 변화를 분석하는 것이 가능한 복합적이고 동적인 생리 시스템을 이해할 수 있는 학문이다. 전사 수준에서의 유전자 발현이 초기 전달 단계에 관련하여 중요한 정보를 제공하기는 하나, mRNA의수준이 관련 단백질의 양과 항상 일치하지는 않은 경우가 종종 발견되었다 (Ideker et al.
	2-DGE 를 통하여단백질을 분리한 후, 선택한 단백질 spot들을 mass spectrometry (MS) 기술 (MALDI-TOF, LC MS/MS)을 적용하여 동정하는 방법의 장점은?	2-DGE 를 통하여단백질을 분리한 후, 선택한 단백질 spot들을 mass spectrometry (MS) 기술 (MALDI-TOF, LC MS/MS)을 적용하여 동정하는 방법은 현재 단백질체 정량 분석의 표준 방법이라 할 수 있다. 2-DGE와 단백질 MS관련 중요 기술들은 이 통합기술이 개발되면서 분석 감도를 높이고, 재현성의 향상및 분석 처리시간 단축 등의 발전을 보이고 있다 (Gygi et al. 2000).

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