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문제 정의
- Urushiol을 제거하려는 시도는 용매를 이용한 urushiol의 제거 방법과(11) 전자선과 방사선 등 전자이온화 에너지를 사용하는 방법(12) 및 버섯균 발효를 이용한 방법(13) 등이 있다. 본 연구에서는 버섯균 발효에 의해서 urushiol 함량이 저감화된 발효옻(13)을 식품소재로 사용하고자 pilot scale로 추출을 시도하였으며, 식품학적 관점에서 추출물의 특성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 옻의 식품사용을 위해서 urushiol의 제거된 추출물을 제조하고 이의 특징을 살펴보았다. 생옻은 물추출에서 3.
제안 방법
- Flavonoid 분석은 HPLC(LC-20A, Shimadzu Co., Tokyo, Japan)를 사용하였으며 분석칼럼은 Symmetry C18(4.6×250 mm, 5 μm, Waters Co., Milford, MA, USA)을 이용하였다.
- Pilot scale 추출물 제조는 발효옻 220 kg에 대하여 (주)성일바이오엑스(Hwaseong, Korea)에서 물추출한 후 동결건조 수행하였으며 제조공정은 제조사의 매뉴얼을 따랐다.
- Urushiol은 catechol ring의 C3위치에 탄소 15-17개가 직쇄상으로 연결된 구조로 물에 난용성인 특징(16)에 착안하여 옻나무 껍질을 100℃에서 8시간 동안 물추출하고 추출물에 urushiol의 존재 여부를 조사하였다. Fig.
- Urushiol이 함유되어 있지 않은 발효옻 물추출물을 제조하기 위하여 추출온도 및 추출시간변화에 따른 고형분, 폴리페놀, 플라보노이드함량 변화를 조사하여 Fig. 2에 나타내었다.
- 3333px;">℃ 이상 추출방법은 압력을 견딜 수 있는 설비가 필요하기 때문에 상당한 비용이 들어간다. 따라서 산업적인 생산을 고려하여 Fig. 3과 같이 발효옻을 pilot 규모로 추출하고 추출물의 이화학적인 특성을 조사하였다. 발효옻 220 kg을 95 옻나무 껍질, 발효옻과 동결건조된 옻나무 껍질 물추출물 및 발효옻 물추출물 10 g에 대하여 3회 추출하였다. 매 추출시마다 깨끗한 n-hexane 100 mL를 시료에 붓고 100 rpm으로 교반하면서 상온에서 4시간 동안 추출한 후 여과물을(Filter paper No. 2, WhatmanTM, GE Healthcare Co., Buckinghamshire, UK) 모았다. 조추출물(hexane 층)을 수분이 모두 증발될 때 까지 감압농축하고 85% MeOH로 녹인 후 여과(0.
- 믹서로 잘게 갈은 발효옻 100 g에 10배 증류수를 첨가한 후 무게를 측정하고 고압살균기에 넣어 80-120℃까지 1시간 간격으로 8시간 동안 추출한 다음 증발된 수분량을 보정하기 위하여 물을 첨가하여 동일무게로 맞추었다. 조추출물을 원심분리(4 믹서로 잘게 갈은 생옻껍질 및 발효옻 100 g에 10배 증류수를 첨가하고 환류냉각 장치를 부착하여 100℃에서 8시간 동안 추출한 다음 원심분리(4℃, 12,000×g, 30 min)하고 여과(filter paper No. 2, WhatmanTM, GE Healthcare Co., Buckinghamshire, UK)한 후 동결건조 하였으며 수 회 반복하여 건조된 추출물을 모았다.
- 상등액을 회수하고 0.02N HCl로 5배(v/v) 희석한 다음 여과(0.2 μm)한 것을 분석하였으며, 분석조건은 제조사의 매뉴얼을 따랐다.
- 시료 100 μL를 취하여 80% ethanol 900 μL를 첨가하였다.
- 옻나무 껍질, 발효옻과 동결건조된 옻나무 껍질 물추출물 및 발효옻 물추출물 10 g에 대하여 3회 추출하였다. 매 추출시마다 깨끗한 n-hexane 100 mL를 시료에 붓고 100 rpm으로 교반하면서 상온에서 4시간 동안 추출한 후 여과물을(Filter paper No.
- 조추출물을 원심분리(4℃, 12,000×g, 30 min)하고 여과(Filter paper No. 2, WhatmanTM, GE Healthcare Co., Buckinghamshire, UK)하였으며, 200 mL 취하여 105℃ 건조법으로 고형분 함량을 구하고 발효옻 100 g에 대한 고형분 함량으로 계산하여 표현하였다.
- 희석된 시료 500 μL를 취하여 10% aluminum nitrate 100 μL와 1 M potassium acetate 100 μL, 80% ethanol 4.3 mL를 차례로 첨가한 후 상온에 40분 반응시키고 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Column은 YMC-Pack Pro C18 RS(4.6×250 mm, i.d. 5 μm, YMC Co., Tyoto, Japan)를 사용하였고 column oven의 온도는 30℃, flow rate는 1.0 mL/min으로 하였다.
- 1% formic acid가 함유된 acetonitrile 용액을 gradient하여 사용하였다. Flavonoid standard(fustin, fisetin, sulfuretin, butein)는 Extrasynthese사(Lyon Nord, France)의 제품을 구매하여 사용하였다.
- Gallic, protocatechuic, syringic, caffeic, ρ-coumaric, salicylic acid 및 4-hydroxy benzoic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고 mandelic, vanillic, ferulic acid는 Fluka(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)사 제품을 사용하였다.
- 본 시험에 사용된 발효옻은 4월에 채취한 충북 옥천산 옻나무 껍질 300 kg을 2×2 cm 크기로 자른 다음 수분이 통할 수 있는 포대에 나누어 담았다.
- 3333px;">℃, 12,000×g, 20 min)하여 상등액을 회수하였다. 분석은 HPLC(Alliance e2695, Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였다. 이때 column은 Supelcosil LC-NH2(4.
- 2 μm)하여 분석용 시료로 사용하였다. 분석은 HPLC(Alliance e2695, Waters Co., Milford, MA, USA)를 이용하였다. Column은 YMC-Pack Pro C18 RS(4.
- 2 μm)한 것을 분석하였으며, 분석조건은 제조사의 매뉴얼을 따랐다. 유리당 분석에 사용한 mannitol, glycerol, glucose, sucrose, maltose는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 0 mL/min, 검출은 280 nm와 370 nm에서 하였다. 이동상으로는 0.1% formic acid가 함유된 물과 0.1% formic acid가 함유된 acetonitrile 용액을 gradient하여 사용하였다. Flavonoid standard(fustin, fisetin, sulfuretin, butein)는 Extrasynthese사(Lyon Nord, France)의 제품을 구매하여 사용하였다.
- 0 mL/min으로 하였다. 이동상은 85% MeOH를 사용하였으며, 검출파장은 254 nm로 하였다. 추출물은 100 8mL/min, 검출파장은 254 nm로 하였다. 이동상은 water:formic acid(200:0.4)와 acetonitrile:MeOH:THF: water:formic acid (43.5:43.5:13:100:0.4)를 사용하였다. Phenolic acid standard는 다음 회사의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 3333px;">℃에서 100분 동안 살균하였다. Choi 등(13)의 방법을 따라 제조된 장수버섯균사체를 접종하고 21℃에서 30일간 배양한 후 50℃에서 열풍 건조시켜 발효옻을 제조하였다.
- Urushiol standard는 전북대학교 식품공학과에서 Choi 등(13) 방법에 따라 분리·보관 중이던 것을 사용하였다.
- 발효옻 추출물에 함유된 수분, 조지방, 조단백질 및 회분함량은 식품공전(15)에 준하여 실시하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s 발색법으로 측정하였다.
- 총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno의 방법(14)을 이용하였다. 시료 100 μL를 취하여 80% ethanol 900 μL를 첨가하였다.
성능/효과
- 따라서 고형분, 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 상업성 등을 감안하면 100℃ 이상에서 6-8시간이 적정할 것으로 판단된다.
- 3과 같이 발효옻을 pilot 규모로 추출하고 추출물의 이화학적인 특성을 조사하였다. 발효옻 220 kg을 95℃에서 2회 물 추출한 결과 건조물 12.5 kg을 얻어 5.7%의 추출수율을 보였다. 실험실 조건(Fig.
- 또한 이러한 이유 때문에 urushiol도 용출되지 않은 것으로 분석된다. 발효옻 추출물에 함유된 폴리페놀 함량은 12,985.9 mg% gallic acid이었으며 플라보노이드 함량은 537.2 mg% quercetin이었다. 이는 추출물 중량에 대하여 각각 13.
- 그러나 발효옻에 함유되어 있는 지용성 성분인 syringic acid, mandelic acid, vanillic acid 등은(19) 용출되지 않았다. 발효옻 추출물에 함유된 플라보노이드는 fisetin이 135.7 mg%로 가장 많이 함유되어 있었으며, sulfuretin, fustin, butein이 뒤를 이었다(Table 3). Gallic acid, fustin 및 fisetin은 발효옻 추출물의 중요한 항산화 물질(3,9,19)이며, 일부 유해 bacteria 및 yeast strain에 대하여 항균활성(9)을 가지고 있을 뿐만 아니라 항암활성(21)도 있다.
- 발효옻 추출물(건조분말)의 일반성분 및 이화학적인 특징은 Table 1에 나타내었다. 발효옻 추출물은 수분 4.34%, 조지방 1.69%, 조단백 10.21%, 조회분 15.80%를 함유하고 있어 단백질과 회분함량이 비교적 많은 비중을 차지하고 있는 것으로 조사되었다. 원료인 발효옻의 조지방(3.
- 발효옻 추출물의 유리아미노산(Table 5)은 24종이 검출되었으며, 유리아미노산의 총량은 3,033.79 ppm이었고 ammonia를 제외하면, alanine(243.6 ppm), serine(231.2 ppm), leucine(218.6 ppm)이 주요 유리아미노산이었다. 필수아미노산의 함량은 967.
- 옻에 함유되어 있는 폴리페놀 및 플라보이드 화합물은 앞서 언급한 기능성 이외에 암세포의 증식억제(21,22), 지방축적 억제(23) 및 항혈전(24) 활성 등을 가지고 있어 추출물 제조에 중요한 요소로 생각된다. 발효옻을 상온에서 물추출 할 경우 추출수율은 3.4%, 용매 추출하여도 최고 5.2%를 넘지 못하였으며, 물추출물(건조물)에 함유된 폴리페놀 함량은 152.1 mg gallic acid, 플라보노이드 함량은 53.1 mg quercetin으로(25) 발효옻 추출물을 제조하기 위해서는 일정온도 이상의 열을 가해주는 것이 좋았다. 따라서 고형분, 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 상업성 등을 감안하면 100 4 mg%의 urushiol이 용출되는 반면 발효옻에서는 용출되지 않았다. 발효옻의 물추출조건은 고형분, 폴리페놀, 플라보노이드 함량이 고려되었으며, 100℃에서 6-8시간 추출하는 것이 적정하였다. 발효옻 추출물의 pilot scale 생산에서 추출수율은 5.
- 옻에 함유된 폴리페놀 및 플라보노이드 성분은 항산화(3-5), 항돌연변이(6), 항염증(7,8) 및 항균과 α-glucosidase 억제효과(9)등이 있는 것으로 나타났다.
- 3333px;">℃ 이상에서는 오히려 감소되었다. 총 고형분 함량(Fig. 2B)에 대한 폴리페놀의 중량비는 80-120℃까지 온도별로 각각 8.9, 8.1, 10.7, 12.7, 9.3%로 90-110℃ 사이에서는 온도증가에 따라 그 비율도 증가하였다. 플라보노이드의 용출량은 추출 8시간 후에 온도별로 각각 303.
- 추출 8시간 후 추출물의 총 고형분 함량은 발효옻 100 g당 7.5 g(80℃) < 8.4 g(90℃) < 9.3 g(100℃) < 11.0 g(110℃) < 13.5 g(120℃) 순으로 추출온도가 10℃ 증가됨에 따라 총 고형분 함량은 각각 12.0, 10.7, 18.2, 22.7%씩 증가하는 것으로 나타났으며, 100℃ 이상의 온도에서 온도증가에 따른 고형분량의 증가가 큰 것으로 조사되었다.
- 2D) 함량 역시 추출온도에 의해서 많은 영향을 받는 것으로 나타났다. 추출 8시간 후 추출물의 폴리페놀 함량은 발효옻 100 g당 gallic acid 함량으로 각각 664.9mg(80℃), 677.7mg(90℃), 990.5mg(100℃), 1393.8mg(110℃), 1255.4 mg(120℃)이었다. 발효옻의 폴리페놀 용출량은 100 미만에서는 큰 차이를 보이지 않았으나 그 이상의 온도에서는 상당한 증가가 관찰되다가 110 7%이었다. 추출물은 수분 4.34%, 조지방 1.69%, 조단백질 10.21%, 조회분 15.80%의 일반성분으로 이루어져 있었으며, 3종류의 phenolic acid와 4종류의 flavonoid가 검출되었다. Phenolic acid중에서는 gallic acid(1,090.
- 3333px;">℃ 이상의 온도에서 온도증가에 따른 고형분량의 증가가 큰 것으로 조사되었다. 추출시간 변화에 따라서는 추출 1시간 까지는 고형분 함량이 급격하게 증가다가 추출 2시간 이후부터 변화가 둔화되었으며 추출 4-6시간 이후에서는 시간이 증가하여도 고형분 함량이 거의 증가하지 않았다. 일반 상업적 추출에 사용되는 추출 온도인 100 54%에 상당한다. 폴리페놀 함량은 실험실 조건에서 추출한 결과와 유사하였으나 플라보노이드 함량은 상당한 차이를 보였으며, 이러한 이유는 명확하지 않다.
- 필수아미노산의 함량은 967.2 ppm으로 전체 함량의 31.9%에 해당하는 상당히 많은 비중을 차지하고 있었으며, 방향족아미노산의 함량은 312.7 ppm, γ-aminobutyric acid 함량은 122.5 ppm인 것으로 나타났다.
후속연구
- 발효옻 물추출물은 urushiol이 제거되었을 뿐 아니라 폴리페놀과 플라보노이드 성분 등의 다양한 기능성분을 함유하고 있으며, 필수 아미노산 및 다양한 유리아미노산을 함유하고 있어 광범위한 식품에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
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