${\\alpha}$1,3-Galactosyltransferase(GalT) 유전자가 완전 Knock-out(-/-)된 바이오장기용 형질 전환 돼지 생산 Production of ${\\alpha}$1,3-Galactosyltransferase (GalT) Double Knock-out (-/-) Transgenic Pigs for Xenotransplantation원문보기
This study was conducted to analyze the transgenic efficiency and sex ratio in ${\alpha}$-1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out (KO) transgenic pigs according to generation. GalT KO piglets were produced by artificial insemination or natural mating. The transgenic confirmation of Gal...
This study was conducted to analyze the transgenic efficiency and sex ratio in ${\alpha}$-1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out (KO) transgenic pigs according to generation. GalT KO piglets were produced by artificial insemination or natural mating. The transgenic confirmation of GalT KO was evaluated by PCR amplification using specific primers. After electrophoresis, three types of bands were detected such as 2.3 kb single band (Wild), 2.3 and 3.6kb double bands (GalT KO -/+; heterozygote), and 3.6kb single band (GalT KO -/-; homozygote). Transgenic efficiency in F1 generation was 64.5% (23/35) of GalT KO (-/+). In F2 generation, GalT KO transgenic efficiency was 36.4% (21/57, Wild), 47.5% (28/57, GalT KO -/+), and 16.1% (8/57, GalT KO -/-), respectively. Interestingly, no homozygote piglets were born in 6 deliveries among total 11 deliveries, although they were pregnant between male (M) and female (F) $F_1$ heterozygote. In the 5 litters including at least one GalT KO -/- piglet, the transgenic efficiency was 13.3% (2/24, Wild), 51.3% (14/24, GalT KO -/+), and 35.3% (8/24, GalT KO -/-), respectively. The sex ratio of M and F was 40:60 in $F_1$ and 49:51 in $F_2$ generation, respectively. Based on these results, GalT KO transgenic pigs have had a reproductive ability with a normal range of transgenic efficiency and sex ratio.
This study was conducted to analyze the transgenic efficiency and sex ratio in ${\alpha}$-1,3-galactosyltransferase (GalT) knock-out (KO) transgenic pigs according to generation. GalT KO piglets were produced by artificial insemination or natural mating. The transgenic confirmation of GalT KO was evaluated by PCR amplification using specific primers. After electrophoresis, three types of bands were detected such as 2.3 kb single band (Wild), 2.3 and 3.6kb double bands (GalT KO -/+; heterozygote), and 3.6kb single band (GalT KO -/-; homozygote). Transgenic efficiency in F1 generation was 64.5% (23/35) of GalT KO (-/+). In F2 generation, GalT KO transgenic efficiency was 36.4% (21/57, Wild), 47.5% (28/57, GalT KO -/+), and 16.1% (8/57, GalT KO -/-), respectively. Interestingly, no homozygote piglets were born in 6 deliveries among total 11 deliveries, although they were pregnant between male (M) and female (F) $F_1$ heterozygote. In the 5 litters including at least one GalT KO -/- piglet, the transgenic efficiency was 13.3% (2/24, Wild), 51.3% (14/24, GalT KO -/+), and 35.3% (8/24, GalT KO -/-), respectively. The sex ratio of M and F was 40:60 in $F_1$ and 49:51 in $F_2$ generation, respectively. Based on these results, GalT KO transgenic pigs have had a reproductive ability with a normal range of transgenic efficiency and sex ratio.
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문제 정의
따라서 본 논문의 목적은 기존에 생산된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지로부터 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지를 생산하는 과정에서 수집된 형질 전환 효율과 성비(sex ratio)에 대해서 분석하고자 실시하였다.
본 연구의 목적은 기존에 생산된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지로부터 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지를 생산하는 과정에서 수집된 형질 전환 효율과 성비(sex ratio)에 대해서 분석하고자 실시하였다. GalT KO된 형질 전환 돼지는 인공수정 또는 자연교미 방법을 통하여 생산하였다.
제안 방법
GalT KO(-/+) 형질 전환 돼지로부터 태어난 F1과 F2 후대 돼지들의 성비(sex ratio)를 확인한 다음 이들의 꼬리 또는 귀 조직 일부를 채취하여 100μg/ml의 proteinase K가 첨가된 조직 용해 용액[10 mM Tris-Cl-pH 8.0, 0.1M EDTA, 0.5% SDS(W/V)]에 침지하여 50℃에서 5시간 동안 용해시켰다.
5% SDS(W/V)]에 침지하여 50℃에서 5시간 동안 용해시켰다. 그 후, phenolchloroform-isoamyl alcohol 용액을 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 형질 전환 여부를 확인하기 위하여 141F(5'-AAT GGTGGAGAGTAGCTGGGAATGTTACAG-3')와 136R(5'-TT ATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT-3') 염기서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다(Fig.
한편 일반 액상정액을 이용한 인공수정의 경우 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지(F0)에서 정액을 채취하여 BTS로 희석한 다음 발정이 확인된 YL 교잡종 암퇘지의 질 내에 40 ml씩 약 18시간 간격으로 2회에 걸쳐 주입하였다. 발정 확인은 발정주기에 있는 암퇘지 중에서 음순의 팽윤 정도와 교미반응을 통해 확인하였다. 자연교미의 경우는 발정이 확인된 암컷 GalT KO(-/+) F1 형질 전환 돼지를 수컷 GalT KO(-/+) F1 형질 전환 돼지와 합사시켜 임신을 유도하였다.
부유된 정액은 발정이 확인된 YL(Yorkshire×Landrace) 교잡종 암퇘지의 질 내에 주입하여 인공수정을 실시하였다.
간단히 요약하면 GalT KO된 체세포를 공여세포로 복제란을 생산한 다음 대리모에 이식한 결과, 3두의 형질 전환 복제돼지를 생산하였으나 분만 직후 폐사하였다. 이들의 체세포를 공여세포로 복제란을 생산하여 대리모에 이식하였으며, GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지 2두를 생산하였다.
부유된 정액은 발정이 확인된 YL(Yorkshire×Landrace) 교잡종 암퇘지의 질 내에 주입하여 인공수정을 실시하였다. 한편 일반 액상정액을 이용한 인공수정의 경우 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지(F0)에서 정액을 채취하여 BTS로 희석한 다음 발정이 확인된 YL 교잡종 암퇘지의 질 내에 40 ml씩 약 18시간 간격으로 2회에 걸쳐 주입하였다. 발정 확인은 발정주기에 있는 암퇘지 중에서 음순의 팽윤 정도와 교미반응을 통해 확인하였다.
형질 전환 여부를 확인하기 위하여 141F(5'-AAT GGTGGAGAGTAGCTGGGAATGTTACAG-3')와 136R(5'-TT ATAGAGAAACAAGAGTCCTAATTGACTTGT-3') 염기서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다(Fig. 1).
대상 데이터
발정 확인은 발정주기에 있는 암퇘지 중에서 음순의 팽윤 정도와 교미반응을 통해 확인하였다. 자연교미의 경우는 발정이 확인된 암컷 GalT KO(-/+) F1 형질 전환 돼지를 수컷 GalT KO(-/+) F1 형질 전환 돼지와 합사시켜 임신을 유도하였다.
이론/모형
GalT KO된 형질 전환 돼지는 인공수정 또는 자연교미 방법을 통하여 생산하였다. GalT KO 여부를 확인하기 위하여 PCR 방법을 이용하였다. PCR 증폭을 실시한 후 전기영동을 실시하여 2.
GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지의 동결 정액 제조방법은 우 등(2011)의 방법에 준하여 실시하였다. 요약하면, 정액 채취 후 희석정액을 상온(25℃)에서 1시간 정도 정치시킨 다음 원심분리(400×g, 15℃, 10분)하였다.
성능/효과
로부터 생산된 후대에서의 형질 전환 효율을 분석한 결과는 Table 1과 같다. GalT KO(-/+) 형질 전환 복제돼지F0로부터 생산된 F1에서의 형질 전환 효율은 총 35마리의 생산된 F1 중에서 23마리가 GalT KO(-/+)가 되었음을 확인하였으며, 형질 전환 효율은 64.5%로 나타났다. 생산된 GalT KO(-/+) F1 돼지 중에는 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제돼지 F0의 동결정액을 이용하여 생산한 F1 2마리가 포함되어 있다.
1). PCR 증폭을 실시한 후 전기영동을 실시하여 2.3 kb 크기에서 단일밴드만 확인이 되면 Wild, 2.3 kb와 3.6 kb 두 개의 밴드를 나타내는 후대를 GalT KO(-/+) 형질 전환 돼지라고 판단하였으며, 3.6 kb 크기에서 단일 밴드만 확인이 되면 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지라고 판단하였다(Fig. 2).
1). PCR 증폭을 실시한 후 전기영동을 실시하여 2.3 kb 크기에서 단일밴드만 확인이 되면 Wild, 2.3 kb와 3.6 kb 두 개의 밴드를 나타내는 후대를 GalT KO(-/+) 형질 전환 돼지라고 판단하였으며, 3.6 kb 크기에서 단일 밴드만 확인이 되면 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지라고 판단하였다(Fig. 2).
본 연구에서 사용된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지 역시 체세포 복제기법을 이용하여 생산하였고(Ahn 등, 2011), 인공수정 또는 자연교미 방법으로 후대를 생산하여 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다. 또한 이들로부터 생산된 F1 세대 또한 F2 세대를 생산함으로써 번식능력에는 이상이 없다는 것을 확인하였다.
한 마리의 모체에서 한 마리라도 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 태어난 경우와 태어나지 않은 경우로 구분하여 분석한 결과, GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 한 마리도 태어나지 않은 그룹에서는 총 33마리가 태어났으나, GalT KO(-/+) 형질 전환된 개체는 15마리로 약 44%로 확인되었다. 반면에 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 한 마리라도 태어난 5마리의 모체로부터 생산된 개체는 총 24마리로써 이들 중에서 GalT 유전자가 전혀 형질 전환되지 않은 개체(Wild)는 2마리로 약 13%로 나타났으며, GalT KO(-/+) 유전형질을 가지고 태어난 개체는 14마리로 파악되어 약 51%의 형질 전환 효율을 나타내었다. 그리고 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지는 8마리로써 약 35%의 형질 전환 효율을 보였다.
본 연구 결과에서는 비록 적은 수의 개체를 대상으로 분석되었으나, F1 세대의 경우 자축의 비율이 다소 높은 경향을 나타내었으며, F2 세대에서는 Wild, GalT KO(-/+) 및 GalT KO (-/-) 개체 모두에서 유사한 비율로 나타났다. 돼지의 경우 순종, 2종 교배 및 3종 교배 간에 생산된 후대의 성비는 50:50으로 나타났다고 보고되었다(Hale과 Bondari, 1986).
본 연구결과에서 F1 세대끼리의 교배를 통해 F2를 생산한다고 하더라도 전체 11마리의 모체 중 6마리에서 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 한 마리도 생산되지 않았다. 그리고 이들로부터 생산된 F2 세대 중에서 약 56%가 GalT 유전자가 형질 전환되지 않은 Wild 개체로 태어났다.
본 연구에서 사용된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제 미니 돼지 역시 체세포 복제기법을 이용하여 생산하였고(Ahn 등, 2011), 인공수정 또는 자연교미 방법으로 후대를 생산하여 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다. 또한 이들로부터 생산된 F1 세대 또한 F2 세대를 생산함으로써 번식능력에는 이상이 없다는 것을 확인하였다.
이상의 결과를 종합하여 보면 바이오장기용으로 생산된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제돼지가 번식적으로 정상임을 확인하였고, 이들로부터 이종 이식이 가능한 바이오장기 생산용 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지 축군 조성이 가능하다는 것을 보여주는 결과라 하겠다.
이상의 결과를 종합하여 보면 바이오장기용으로 생산된 GalT KO(-/+) 형질 전환 복제돼지가 번식적으로 정상임을 확인하였고, 이들로부터 이종 이식이 가능한 바이오장기 생산용 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지 축군 조성이 가능하다는 것을 보여주는 결과라 하겠다.
흥미로운 것은 비록 GalT KO -/+ 끼리의 교배라 하더라도 한배에서 한 마리의 GalT KO 개체가 태어나지 않은 경우가 6 모체나 되었다. 최소 한 마리 이상의 GalT KO -/+형질 전환 돼지가 태어난 5 모체의 경우 형질 전환 효율은 13.3%(2/24, Wild), 51.3%(14/24, GalT KO -/+) 및 35.3%(8/24, GalT KO -/-)로 나타나 표현형에서 차이가 많이 나타남을 확인할 수 있었다. 후대에서의 성비를 분석한 결과, 웅축과 자축의 비율이 F1 세대에서는 40:60 그리고 F2 세대에서는 49:51의 비율로 태어났다.
3마리가 태어난 것으로 확인되었다. 한 마리의 모체에서 한 마리라도 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 태어난 경우와 태어나지 않은 경우로 구분하여 분석한 결과, GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 한 마리도 태어나지 않은 그룹에서는 총 33마리가 태어났으나, GalT KO(-/+) 형질 전환된 개체는 15마리로 약 44%로 확인되었다. 반면에 GalT KO(-/-)된 형질 전환 돼지가 한 마리라도 태어난 5마리의 모체로부터 생산된 개체는 총 24마리로써 이들 중에서 GalT 유전자가 전혀 형질 전환되지 않은 개체(Wild)는 2마리로 약 13%로 나타났으며, GalT KO(-/+) 유전형질을 가지고 태어난 개체는 14마리로 파악되어 약 51%의 형질 전환 효율을 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
체세포 복제 기법이 개발된 이론적 배경은?
체세포 복제 기법은 자연적으로 우수한 형질을 가진 개체 또는 원하는 특정 형질을 가진 개체를 무제한으로 생산이 가능하다는 이론적 배경을 바탕으로 개발되었다. 양(Campbell 등, 1996), 소(Kato 등, 1998), 염소 (Baguisi 등, 1999) 및 돼지(Polejaeva 등, 2000) 등 여러 종에서 체세포 복제 동물이 생산되었다고 보고되었다.
돼지와 영장류 간의 이종간 장기이식 중 가장 큰 장애가 되는 항원 결합 부위는?
심각한 사람의 장기 부족 현상을 극복하기 위한 방법 중의 하나로 대체(alternative) 동물의 장기를 이종 장기의 공급원으로 사용하고자하는이종장기이식연구가시작되었다(Evans, 2001). 하지만 돼지와 영장류 간의 이종간 장기이식에 있어서 가장 큰 장애는 돼지 세포의 표면에 존재하는 terminal α-1,3-galactosyl epitopes이다(Lai 등, 2002; Puga 등, 2009). 이 α-1,3-Galactosyltransferase( GalT) 당단백질은 초급성 면역 거부 반응(hyperacute immune rejection)과 직접적으로 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(Cooper 등, 1993a, b; Lambrigts 등, 1998), 이 유전자를 제거(knock-out, KO)한 형질 전환 복제 돼지가 생산되면서(Dai 등, 2002; Phelps 등, 2003; Kolber-Simonds 등, 2004; Nottle 등, 2007) 돼지를 이용한 이종 장기 생산 연구가 활발 하게 이루어지고 있다.
바이오 장기용 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지 축군을 조성에 필요한 형질전환 돼지는 어떤 것이 있나요?
바이오장기용 GalT가 KO된 돼지의 장기를 이종이식용으로 활용하기 위해서는 heterozygote(GalT KO -/+) 상태가 아닌 homozygote(GalT KO -/-) 상태의 돼지가 필요하다. 이를 위해서는 Wild와 GalT KO(-/+) 간의 교배 그리고 생산된 GalT KO(-/+) 간의 교배를 통해서 GalT KO(-/-) 형질 전환 돼지 축군을 조성해야만 한다.
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