[논문]돼지 혈관내피세포 특이적 CD73 발현 벡터가 도입된 돼지 섬유아세포 생산

오건봉; 이해선; 황성수; 옥선아; 정학재; 변승준; 이풍연; 임기순

doi:10.12750/jet.2016.31.3.161

돼지 혈관내피세포 특이적 CD73 발현 벡터가 도입된 돼지 섬유아세포 생산
Production of porcine fibroblasts carrying a vector enforced specific expression of CD73 to endothelial cells 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.31 no.3, 2016년, pp.161 - 168

Abstract ▼ AI-Helper

Nucleotide metabolism in endothelium is variable between different species. Recent studies demonstrated that this variability could contribute coagulation dysfunction, even though organs of the alpha 1,3-galactosyltransferase gene knockout pig were transplanted into the primate. CD73 (ecto-5'-nucelotidase) is an enzyme at cell surface catalyzing the hydrolysis of adenosine triphosphate to adenosine, which plays role on a substance for anti-inflammatory and anti-coagulant. Thus, overexpression of CD73 in endothelial cells of the pig is considered as an approach to reduce coagulopathy. In this study, we constructed a human CD73 expression vector under control of porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD73), which is expressed specifically at endothelial cells, and of CMV promoter as a control (CMV-CD73). First, we transfected the CMV-CD73 vector into HEK293 cells, and then confirmed CD73 expression at cell surface by flow cytometry analysis. Next, we transfected the pIcma2-CD73 and CMV-CD73 vectors into primary porcine fibroblasts and endothelial cells. Consequence was that the pIcma2-CD73 vector was expressed only at the porcine endothelial cells, meaning that the pIcam2 promoter lead to endothelial cell-specific expression of CD73 in vitro. Finally, we nucleofected the pIcam2-hCD73 vector into passage 3 fibroblasts, and enforced hygromycin selection of 400mg/ml. We were able to obtain forty three colonies harboring pIcam2-CD73 to provide donor cells for transgenic cloned porcine production.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 혈관내피세포에서 특이적으로 발현하는 돼지의 Intercellular adhesion molecule2(Icam2) 프로모터에 CD73유전자를 연결한 pIcam2-CD73 발현벡터를 제작하였다. 상기벡터를 돼지에서 추출한 초기 섬유아세포와 혈관 내피세포에 도입시킨 후 발현을 분석한 결과 CD73은 혈관 내피세포에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다.

제안 방법

, 2012). 따라서 본 연구에서는 CD73의 발현을 혈관 내피세포로 제한하고자 발현 조절 부위를 Icam-2 프로모터로 사용하기로 하였다. 이전의 연구에서 사람 Icam-2 프로모터는 체외와 체내에서 혈관 내피세포에 특이적으로 외래 유전자의 발현을 조절한다고 보고 되었으며(Cowan et al.

대상 데이터

양쪽 말단에 제한 효소 Not I과 Xho I 인식 염기서열을 삽입시킨 앞쪽 프라이머 5’-ATGCGGCCGCTTTCGCACCCAGTTCAC-3’와 뒤쪽 프라이머 5’-AATCTCTCGAGCTATTGGTATAAAACAAAG-3’로 PrimeSTAR™ HS DNA polymerase (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)를 사용하여 PCR 방법으로 합성하였다. 돼지의 Icam-2 프로모터는 돼지 귀 조직에서 추출한 genimic DNA를 주형으로 제한효소 Nru I과 Hind III 인식 염기서열을 삽입시킨 프라이머5′-TATCGCGATCTAGAAACACACTGCAAGTCC-3′와 5′-ATAAGCTTAGGAAAGAGCCGAGGACCGCCT-3′를 사용하여 PCR 방법으로 합성하였다. 합성된 CD73 cDNA를 pcDNA3.
사람 CD73 cDNA 클론은 21C Frontier Human Gene Bank(Korea, Clone ID, Hmu001092)에서 구입하였다. 양쪽 말단에 제한 효소 Not I과 Xho I 인식 염기서열을 삽입시킨 앞쪽 프라이머 5’-ATGCGGCCGCTTTCGCACCCAGTTCAC-3’와 뒤쪽 프라이머 5’-AATCTCTCGAGCTATTGGTATAAAACAAAG-3’로 PrimeSTAR™ HS DNA polymerase (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)를 사용하여 PCR 방법으로 합성하였다.

이론/모형

5M EDTA (Thermo, IL, USA) 첨가된 mammalian protein extract reagent 용액(Thermo)으로 0 ℃에서 1시간 동안 용해시켰다. 단백질 추출 후 Bradford 분석 방법(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 정량 하였다. 20μg의 단백질을 4-20% mini-protean^® TGX™ precast gel (Bio-Rad)에서 분리시킨 후, polyvinylidene fluoride membrane (Bio-Rad)으로 이동시켰다.
돼지의 Icam2 프로모터의 조절에 의해 CD73의 발현이 혈관내부 세포에만 제한적으로 발현이 조절되는지 알아보기 위하여 초기 돼지 섬유아세포와 돼지 혈관 내피세포에 위의 두 벡터를 nucleofection 방법으로 도입하였다. 그림 3A에 나타낸 것처럼 웨스턴 블롯 분석한 결과 돼지 섬유아세포에서는 CMV 프로모터의 조절에 의해 CD73이 발현되지만 돼지 Icam-2 프로모터에 의해서는 CD73이 발현되지 않았다.

성능/효과

그렇지만 돼지 혈관 내피세포에서는 비록 CMV 프로모터에 의한 것보다 발현 수준이 낮았지만, 돼지 Icam2 프로모터에 의해 발현되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 약 900bp의 돼지 Icam-2 프로모터는 혈관 내피세포에서의 특이적 발현을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
, 2007)은 돼지 심장에서 CD73의 활성능은 사람의 심장에서 보다 약 4배 정도 낮으며, 신장과 혈관 내부세포에서도 유사한 비율로 사람의 것보다 돼지에서 낮다고 보고하였다. 이러한 관점에서 보면 혈관 내부세포에서 pIcam2-CD73 벡터로부터 발현된 CD73의 수준은 낮은 것이 아니라고 판단되며, 또한 특이적인 발현을 유도하므로 혈관성 거부반응 제어 관련 유전자 발현을 위한 프로모터로 활용하는데 적당하다고 생각된다.

후속연구

, 2016). 본 연구에서 개발한 CD73발현 벡터가 도입된 체세포주를 활용하여 돼지가 생산된다면, GalT KO/CD46돼지(Hwang et al., 2013; Ko et al., 2013)와 교배를 통해 복합 형질전환 돼지를 개발한 후 그 장기를 원숭이에 이식하는 이종이식용 모델로서 활용한다면 염증반응과 혈액응고 반응과 같은 급성 혈관성 거부반응을 이해하고 제어하기 위한 연구 재료로 가치가 있을 것이라 기대된다.
상기벡터를 돼지에서 추출한 초기 섬유아세포와 혈관 내피세포에 도입시킨 후 발현을 분석한 결과 CD73은 혈관 내피세포에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 pIcam2-CD73 벡터를 활용하면 이종이식용 형질전환 돼지를 생산하여 혈액응고를 억제시킬 수 있는 모델동물 생산에 적용할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	퓨린 신호전달은 어떤 과정인가?	혈액에서 ATP가 아데노신으로 분해되는 과정인 퓨린 신호전달(purinergic signaling) 경로에는 핵산 분해효소인 CD39도관여하여 ATP를 adenosine 5’-driphosphate(ADP), adenosine 5’-monohosphate(AMP)로 분해시킨다. 특히 CD39는 핵산 분해효소 중에서 다른 효소들과 비교하였을 때 가장 효과적으로 CD73과 상호작용을 한다고 보고되고 있다(Fausther et al.
	분해된 아데노신은 어떤 기능이 있는가?	, 1986; Zimmermann, 1992). 분해된 아데노신은 세포보호 기능, 면역억제 기능, 혈소판 활성억제의 생리 및 약리적 특성을 갖고 있다 (Daval et al., 1991; Delikouras et al.
	돼지 장기를 영장류에 이식하게 되면 초급성 면역거부반응이 발생할 수 있는데 이를 극복하기 위해 무엇을 하였는가?	돼지의 장기를 영장류에 이식하게 되면 초급성 면역거부반응이라고 알려진 거부반응이 이식된 장기에서 발생한다(Yang and Sykes, 2007). 이러한 문제점을 극복하기 위하여 이 반응의 원인 유전자인 α1,3-Galactosyltransferase(GalT)의 기능이 제거된 돼지(knock out, KO)가 생산되었고(Kolber-Simonds et al., 2004; Nottle et al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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