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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 실험과정의 단순화와 염증성 장질환에 대한 재조합 단백질의 보다 효율적인 기능분석을 위해 초파리 장세포를 일차 배양(primary culture) 하였으며, 본 연구에서 확립한 일차 배양 장세포는 초파리 장세포를 이용한 일차 배양의 최초 보고이다.
- 본 연구에서 구축한 일차배양 장세포가 살아있는 초파리의 장과 동일한 세포들로 구성되어 있어서 초파리의 장을 대상으로 하는 여러가지 연구에 적합한지를 확인하기 위해 초파리 장을 구성하는 세포인 enterocyte, enteroblast, enteroendocrine cell 및 ISC 존재 여부를 확인하였다. 전체적인 세포의 이미지는 DAPI staining에 의해 확인하였고, ISC 및 enteroendocrine cell의 마커로 각각 delta와 prospero를 사용하여 immunostaining을 실시하였다(Fig.
제안 방법
- 250× g에서 5분간 원심분리하여 회수한 세포를 슬라이드글라스에 미리 점적한 Vectashield mounting solution (VECTOR, USA)에 mounting하여 세포를 DAPI (4‘,6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 다음 형광현미경 (Carl Zeiss DE/Axio Imager A1, Germany)으로 형광염색 여부를 관찰하였다.
- CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 이용하여 일차배양한장 세포(5×105 cells/ml)를 96-well plate에 분주하고 각 well에 CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent 10 μl를 첨가한 후 4시간 동안 반응 시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- PBS를 제거하고 상온에서 15분 동안 4% Formaldehyde/1×PBS (Sigma, USA)를 이용하여 세포를 고정하고 상온에서 0.1% Triton X-100/PBS로 2회 세척한 후 5% horse serum/1% BSA/1×PBS로 1시간 30분 동안 상온에서 blocking 하였다.
- 곤충의 중장은 사람의 위에 해당하므로 많은 다양한 장내미생물이 존재할 뿐만 아니라 초파리 사료에도 효모 등 다양한 미생물이 포함되어져 있으므로 가능한 장 내 미생물 수를 최소화하기 위해 장 해부에 앞서 초파리의 먹이로 5일 동안 5%의 sucrose만을 급여하였다. 그 후 초파리 성충을 해부하여 장을 분리하고 염소 소독제인 1.
- 그리고 ISC 분열 및 분화 촉진을 통해 장 손상 복구에 중요한 역할을 수행할 것으로 추정되는 후보 유전자를 선발하고 그 기능을 분석하고자 하였으나, 초파리 생체를 이용한 실험의 경우 후보 유전자로부터 발현한 재조합 단백질의 기능 검증을 위해 초파리에 경구투여를 할 경우 다양한 protease 등의 작용에 의해 목적지인 ISC가 존재하는 중장에까지 고유의 구조와 기능을 가지고 도달하기 힘들다는 단점을 가지고 있었다. 따라서 우리는 본 연구에서 ISC 분열 및 분화 촉진 기능을 가질 것으로 추정되는 후보 유전자의 효율적인 기능 분석뿐만 아니라 나아가 다양한 장에서 발생하는 질환 연구에 유용하게 이용될 장세포 일차배양을 초파리를 이용하여 시도하였다.
- 세척된 장세포는 1×penicillin-streptomycin (Gibco USA), 1×Fungizone (Gibco USA), 1×gentamycin (Gibco, USA) 및 10% FBS를 첨가한 Schneider's 배지를 이용하여 매일 배지를 교체하며 배양하였다.
- 장세포의 일차 배양을 위해 100마리의 암컷 초파리를 5일간 5% sucrose만을 먹인 후 10×penicillin-streptomycin이 들어있는 1×PBS (Sigma, USA)에 침지한 상태에서 장을 분리하고, 70% 에탄올로 5분씩 2회 소독한 후 1×PBS로 3회 세척하였다. 수술용 가위와 메스를 이용하여 조직을 잘게 썰고, homogenizer (Fisher Scientific, USA)를 이용하여 장 조직을 분쇄한후 Pasteur pipet (Volac, England)으로 pipetting을 충분히 하여 조직을 작은 절편으로 만들었다. 그 다음 250× g에서 5분동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 25℃에서 TrypsinEDTA (Promega, USA)를 10분간 처리하였다.
- 일차 배양 장세포에 포함된 세포 종류 확인을 위해 immunostaining을 수행하였다. Immunostaining을 위하여 일차 항체로는 1:100 delta (Hybridoma Bank, USA)와 1:1,500 prospero (Hybridoma Bank, USA)를 사용하였다.
- CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 이용하여 일차배양한장 세포(5×105 cells/ml)를 96-well plate에 분주하고 각 well에 CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent 10 μl를 첨가한 후 4시간 동안 반응 시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 일차세포 배양 후 세포의 형태 및 오염여부 확인을 위해 광학현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 40배 배율로 1일 간격으로 14일 동안 관찰하고 세포 사진을 촬영하였다.
- 장세포의 일차 배양을 위해 100마리의 암컷 초파리를 5일간 5% sucrose만을 먹인 후 10×penicillin-streptomycin이 들어있는 1×PBS (Sigma, USA)에 침지한 상태에서 장을 분리하고, 70% 에탄올로 5분씩 2회 소독한 후 1×PBS로 3회 세척하였다.
- 본 연구에서 구축한 일차배양 장세포가 살아있는 초파리의 장과 동일한 세포들로 구성되어 있어서 초파리의 장을 대상으로 하는 여러가지 연구에 적합한지를 확인하기 위해 초파리 장을 구성하는 세포인 enterocyte, enteroblast, enteroendocrine cell 및 ISC 존재 여부를 확인하였다. 전체적인 세포의 이미지는 DAPI staining에 의해 확인하였고, ISC 및 enteroendocrine cell의 마커로 각각 delta와 prospero를 사용하여 immunostaining을 실시하였다(Fig. 4, 5). 그 결과 DAPI와 delta staining에 의해 염색되는 장을 구성하는 세포중 크기가 가장 적은 성체 장줄기세포(ISC)를 확인할 수 있었다(Fig.
- 한편, prospero 염색에 의해 prospero 및 DAPI에 동시 염색되는 장 내분비세포(enteroendocrine cell)의 존재를 확인하였다(Fig. 5). DAPI는 청색의 형광 염료로서 DNA의 AT cluster가 있는 minor groove에 결합하는 형광물질이어서 모든 세포에 염색되므로[10], DAPI에 의해 염색되면서 prospero나 delta에 의해 염색되지 않은 세포 중 크기가 큰 세포는 enterocyte, 크기가 작은 세포는 enteroblast로 추정되었다.
대상 데이터
- 일차 배양 장세포에 포함된 세포 종류 확인을 위해 immunostaining을 수행하였다. Immunostaining을 위하여 일차 항체로는 1:100 delta (Hybridoma Bank, USA)와 1:1,500 prospero (Hybridoma Bank, USA)를 사용하였다. 우선 일차배양한 장세포를 1×PBS로 2회 세척하고 1.
- 초파리는 살아있는 당밀/효모의 표준배지인 효모 corn- meal-agar-sucrose 배지로 사육되었고, 초파리 stock은 19℃에서 유지되었으며 모든 실험은 25℃에서 이루어졌다. 본 실험에서는 야생형인 Canton-S (CS) 품종을 사용하였다.
- 초파리는 살아있는 당밀/효모의 표준배지인 효모 corn- meal-agar-sucrose 배지로 사육되었고, 초파리 stock은 19℃에서 유지되었으며 모든 실험은 25℃에서 이루어졌다. 본 실험에서는 야생형인 Canton-S (CS) 품종을 사용하였다.
이론/모형
- 장 일차배양 세포의 생장률을 확인하기 위해 MTS assay를수행하였다. CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 이용하여 일차배양한장 세포(5×105 cells/ml)를 96-well plate에 분주하고 각 well에 CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent 10 μl를 첨가한 후 4시간 동안 반응 시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 4, 5). 그 결과 DAPI와 delta staining에 의해 염색되는 장을 구성하는 세포중 크기가 가장 적은 성체 장줄기세포(ISC)를 확인할 수 있었다(Fig. 4). Delta에 의해 염색되는 세포수는 DAPI에 의해 염색되는 세포의 약 10%를 차지하였으므로 초파리의 생체에서와 마찬가지로 ISC는 전체 장세포 중 각각 약 10%를 차지 함을 추정할 수 있었다[3].
- 5% chlorine bleach는 사용하지 않고 70% 에탄올로만 5분간 2회 소독을 실시해 보았다. 그 결과 세포가 미생물에 오염되지 않아 일차배양 후 14일째까지 미생물에 오염되지 않고 세포가 잘생존함을 현미경 검경을 통해 확인할 수 있었다(Fig. 2). 그리고 cell proliferation 분석을 통해 최대성장시기, 세포생존기간 및 세포생장곡선 등을 확인하기 위해 MTS assay를 수행한 결과 세포는 일차배양 시작 후 서서히 증식하여 8일째 최대로 분열됨을 확인하였고, 그 이후 서서히 세포수가 감소하였으며, 최대 14일까지 유지됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 곤충의 중장은 사람의 위에 해당하므로 많은 다양한 장내미생물이 존재할 뿐만 아니라 초파리 사료에도 효모 등 다양한 미생물이 포함되어져 있으므로 가능한 장 내 미생물 수를 최소화하기 위해 장 해부에 앞서 초파리의 먹이로 5일 동안 5%의 sucrose만을 급여하였다. 그 후 초파리 성충을 해부하여 장을 분리하고 염소 소독제인 1.5% chlorine bleach로 5분간 1회 소독한 후 세포를 배양한 결과 배양 후 5일째부터 세포의 배양액이 미생물로 오염되었음을 현미경 검경을 통해 확인할수 있었다. 그리고 장을 70% 에탄올과 1.
- 2). 그리고 cell proliferation 분석을 통해 최대성장시기, 세포생존기간 및 세포생장곡선 등을 확인하기 위해 MTS assay를 수행한 결과 세포는 일차배양 시작 후 서서히 증식하여 8일째 최대로 분열됨을 확인하였고, 그 이후 서서히 세포수가 감소하였으며, 최대 14일까지 유지됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 그리고 장을 70% 에탄올과 1.5% chlorine bleach를혼합해서 5분간 1회 소독한 경우에는 미생물의 오염은 없었으나 세포가 손상되어서 핵에 염색되는 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색결과 대부분의 세포가 염색되지 않음을 확인할 수 있었고, MTS assay에 의해서도 대부분의 세포가 사멸되었음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- Delta에 의해 염색되는 세포수는 DAPI에 의해 염색되는 세포의 약 10%를 차지하였으므로 초파리의 생체에서와 마찬가지로 ISC는 전체 장세포 중 각각 약 10%를 차지 함을 추정할 수 있었다[3]. 따라서 본 연구에서 구축한 일차 배양세포는 생체 장세포 환경과 유사하므로 ISC 분열 및 분화 촉진 기능을 가질 것으로 추정되는 후보 유전자의 효율적인 기능 분석을 통한 ISC 분열 및 분화조절 연구에 유용할 것으로 추정되었다.
- DAPI는 청색의 형광 염료로서 DNA의 AT cluster가 있는 minor groove에 결합하는 형광물질이어서 모든 세포에 염색되므로[10], DAPI에 의해 염색되면서 prospero나 delta에 의해 염색되지 않은 세포 중 크기가 큰 세포는 enterocyte, 크기가 작은 세포는 enteroblast로 추정되었다. 따라서, 본 연구에서 구축한 일차배양 장세포에는 생체와 동일하게 초파리 장에 존재하는 모든 세포가 존재하므로 생체 내의 장과 유사할 것으로 추정되므로 본 연구에서 구축된 세포는 염증성 장질환과 관련된 장줄기세포 조절 연구뿐만 아니라 장에서 발병하는 다양한 질병 기작 연구에 보다 용이하게 이용될 것으로 기대된다.
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