발암성 ethyl carbamate의 전구물질인 요소의 분해를 촉매하는 urease 생산 효모를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 우리나라 전통 누룩으로부터 약 223주의 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 있는 6 균주를 선별하였다. 분리된 6 균주는 ITS I-5.8S-ITS II 영역의 PCR-RFLP 분석 및 계통분석을 통하여 이 균주 모두가 $I.$$orientalis$ ATCC 24210과 99.8% 이상의 염기서열상동성을 나타내어 유전적으로 매우 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다. 분리 효모 중 uresae 활성이 가장 강한 2 균주 JJ22와 SH10을 선정하여 형태학적, 생리학적 특성을 조사한 결과 $I.$$orientalis$와 특성이 거의 유사하여 $I.$$orientalis$로 동정하였다. 이 균주들은 온도 $20-40^{\circ}C$의 넓은 범위에서 생육이 양호하였으며 JJ22의 경우에는 $35^{\circ}C$, SH10의 경우에는 $30^{\circ}C$에서 urease 활성이 가장 높았다. pH의 영향을 조사한 결과 pH 2.0-6.0까지 넓은 범위의 산성 조건에서 생육이 매우 양호하여 호산성 효모로 생각된다. Urease 효소의 활성은 PH 5.0에서 최대치를 나타내었고 pH가 감소하거나 높아짐에 따라 활성이 감소하였다.
발암성 ethyl carbamate의 전구물질인 요소의 분해를 촉매하는 urease 생산 효모를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 우리나라 전통 누룩으로부터 약 223주의 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 있는 6 균주를 선별하였다. 분리된 6 균주는 ITS I-5.8S-ITS II 영역의 PCR-RFLP 분석 및 계통분석을 통하여 이 균주 모두가 $I.$$orientalis$ ATCC 24210과 99.8% 이상의 염기서열 상동성을 나타내어 유전적으로 매우 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다. 분리 효모 중 uresae 활성이 가장 강한 2 균주 JJ22와 SH10을 선정하여 형태학적, 생리학적 특성을 조사한 결과 $I.$$orientalis$와 특성이 거의 유사하여 $I.$$orientalis$로 동정하였다. 이 균주들은 온도 $20-40^{\circ}C$의 넓은 범위에서 생육이 양호하였으며 JJ22의 경우에는 $35^{\circ}C$, SH10의 경우에는 $30^{\circ}C$에서 urease 활성이 가장 높았다. pH의 영향을 조사한 결과 pH 2.0-6.0까지 넓은 범위의 산성 조건에서 생육이 매우 양호하여 호산성 효모로 생각된다. Urease 효소의 활성은 PH 5.0에서 최대치를 나타내었고 pH가 감소하거나 높아짐에 따라 활성이 감소하였다.
Two hundred and twenty three yeast strains were randomly isolated from Korean traditional $nuruk$. Among them, six urease producing yeast strains (designated JJA, JJB, JJ22, SHA, SHC and SH10) were selected on the Christensen urea agar plates. They showed the same pattern in the PCR-RFLP ...
Two hundred and twenty three yeast strains were randomly isolated from Korean traditional $nuruk$. Among them, six urease producing yeast strains (designated JJA, JJB, JJ22, SHA, SHC and SH10) were selected on the Christensen urea agar plates. They showed the same pattern in the PCR-RFLP analysis of the ITS I-5.8S-ITS II region digested with $Hae$III and $HinF$1 restriction endonucleases. Its DNA sequences showed 100% (strains SHA, SHC and SH10) and 99.8% (strains JJA, JJB and JJ22) identity with those of $Issatchenkia$$orientalis$ type strain ATCC 24210. Phylogenetic analysis resulted in that all the strains were closely related to $I.$$orientalis$. Two representative strains, JJ22 and SH10, showing the highest urease activities were selected for further characterization. Their morphological, physiological and biochemical characteristics were also the same as $I.$$orientalis$. Therefore, both the two strains were identified as $I.$$orientalis$. They could grow at a wide range of temperature between $20-40^{\circ}C$ as well as pH between 2.0 and 10.0. However, a higher level urease activity were obtained at acidic pH than that at alkalic pH. The maximal level of urease activity was obtained at $30^{\circ}C$ (strain SH10) or $35^{\circ}C$ (strain JJ22) and in a liquid medium adjusted to the initial pH 5.0.
Two hundred and twenty three yeast strains were randomly isolated from Korean traditional $nuruk$. Among them, six urease producing yeast strains (designated JJA, JJB, JJ22, SHA, SHC and SH10) were selected on the Christensen urea agar plates. They showed the same pattern in the PCR-RFLP analysis of the ITS I-5.8S-ITS II region digested with $Hae$III and $HinF$1 restriction endonucleases. Its DNA sequences showed 100% (strains SHA, SHC and SH10) and 99.8% (strains JJA, JJB and JJ22) identity with those of $Issatchenkia$$orientalis$ type strain ATCC 24210. Phylogenetic analysis resulted in that all the strains were closely related to $I.$$orientalis$. Two representative strains, JJ22 and SH10, showing the highest urease activities were selected for further characterization. Their morphological, physiological and biochemical characteristics were also the same as $I.$$orientalis$. Therefore, both the two strains were identified as $I.$$orientalis$. They could grow at a wide range of temperature between $20-40^{\circ}C$ as well as pH between 2.0 and 10.0. However, a higher level urease activity were obtained at acidic pH than that at alkalic pH. The maximal level of urease activity was obtained at $30^{\circ}C$ (strain SH10) or $35^{\circ}C$ (strain JJ22) and in a liquid medium adjusted to the initial pH 5.0.
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문제 정의
이러한 미생물로 대표적인 것은 유산균과 효모를 들 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 산업적으로 유용한 urease를 생산하는 효모의 분리를 목적으로 우리나라 전통주 제조에 사용되는 전통누룩으로부터 다양한 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 강한 효모를 선별하여 미생물학적 특성과 urease 생산능을 조사하였다.
8S-ITS II 영역의 염기서열은 균주에 따라 차이가 심하여 분자생물학적 계통분석에 널리 이용되고 있다(25-28). 본 연구에서는 분리 균주의 특성을 알아보고자 PCR-RFLP 분석 및 이 영역의 염기서열을 기반으로 한 계통분석을 행하였다. 분리 효모 6 균주의 DNA를 주형으로 하여 ITS I-5.
제안 방법
1차 분리한 균주를 urease 생산 균주의 선택배지인 Christensen's urea agar slant를 이용하여 30℃에서 약 7일간 배양하여 urease를 생산하는 6 균주를 2차 선별하였다.
DNA 전기영동은 일반적인 방법(20)에 준하여 1.2% agarose gel, 0.5×TBE buffer를 사용하여 100 V의 전압으로 전기영동 후 0.5 mg/mL ethidium bromide (EtBr) 용액으로 염색한 후 UV transilluminator (Vilber Lourmat, Paris,France)로 관찰하였다.
Polymerase chain reaction (PCR)은 Gene cycleTM(Bio-Rad Co code 9084, Hercules, USA)를 사용하여 일반적인 방법(20)에 따라 총 반응액 양이 50 μL가 되게 하여 행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편의 분석을 위하여 제한 효소로는 HaeⅢ, HinfⅠ을 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. DNA 전기영동은 일반적인 방법(20)에 준하여 1.
5 g sodium hydroxide와 21 mL sodium hypochlorite를 첨가하여 500 mL로 정용하여 사용하였다. Urease 효소 활성 측정은 McIlvaine buffer (pH 5.0) 0.25 mL에 McIlvainebuffer (pH 5.0)에 urea를 녹여 최종 농도가 0.5 M이 되도록 첨가하고 urease 활성 측정 최적배지에서 배양하여 원심분리하여 얻은 상등액 0.5 mL를 잘 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 Weatherburn의 indo phenol 시약을 사용하여 생성된 암모니아를 정량하였다. Urease 효소 활성의 단위는 본 실험의 반응조건에서 1시간 동안 요소를 분해하여 암모니아 1 nmol을 생산하는 효소의 양으로 환산하였다.
균주 JJ22와 SH10의 urease 활성과 균 생육도에 미치는 배양 온도의 영향을 조사하기 위하여 배양 온도를 20, 25,30, 35및 40℃로 조정한 다음 각 조건에서의 urease 활성을 조사한 결과는 Fig. 4와 같다. 균의 생육은 2 균주 모두 온도에 따라 거의 차이가 없어 생육온도의 영역이 넓은 것으로 생각된다.
누룩에서 분리한 효모에서 urease 생산 효모를 선별하기 위하여 분리한 균을 Sigma-Aldrich 사의 Christensen's urea agar 평판배지에 접종하여 30℃에서 5일간 배양 후 핑크색을 띄는 것을 요소 분해능 양성으로 판단하였다.
발암성 ethyl carbamate의 전구물질인 요소의 분해를 촉매하는 urease 생산 효모를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 우리나라 전통 누룩으로부터 약 223주의 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 있는 6 균주를 선별하였다.
4%의 sodium propionate를 첨가한 YPD 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 다음 효모 균주를 분리하였다. 분리한 균주는 현미경에서 검경하여 효모의 형을 취하고 있는 것만을 골라서 YPD 배지에서 4회 계대 배양하여 순수분리하였다. 누룩에서 분리한 효모에서 urease 생산 효모를 선별하기 위하여 분리한 균을 Sigma-Aldrich 사의 Christensen's urea agar 평판배지에 접종하여 30℃에서 5일간 배양 후 핑크색을 띄는 것을 요소 분해능 양성으로 판단하였다.
Urease 생산 효모의 동정을 위하여 분리 균의 배양학적, 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하여 Kurtzman과 Fell의 The Yeast, A Taxonomic Study (22)에 따라 분류 동정하였다. 효모의 계통분석을 위한 DNA 염기서열은 SolGent 사(Daejeon, Korea)의 Sequencing Service를 의뢰하여 분석하였다. 염기서열 결과에 대한 서열간의 유사성을 알아보는 상동성 검색은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 운영하는 BLAST를 이용하였고 계통분석을 위한 다중서열정렬(Multiple Sequence Alignment)은 European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)에서 제공하는 Clustal W2를 이용하였다.
대상 데이터
5 mg/mL ethidium bromide (EtBr) 용액으로 염색한 후 UV transilluminator (Vilber Lourmat, Paris,France)로 관찰하였다. DNA 단편의 size 측정용 marker로는 100 bp DNA ladder (Solgent, Lot No 100BP056ZP, Daejeon,Korea)를 사용하였다.
Lois, Mo USA)를 사용하였다. 그리고 urease 활성 측정을 위한 배양배지로는 YNB 배지(0.17% YNB base w/o ASand AA, 1% glucose, 0.1% urea, 5% NaCl)를 사용하였다.
본 실험에서 사용한 배지는 누룩에서 효모 분리와 증식을 위한 배양 배지로 곰팡이 생육을 억제하기 위하여 0.4% sodium propionate를 첨가한 YPD 배지(1.0% Yeast extract,2% Peptone, 2% Dextrose)를 사용하였고 urease 생산 효모 분리 배지는 Christensen‘s urea agar 배지(Sigma-Aldrich,St. Lois, Mo USA)를 사용하였다.
실험에 사용한 누룩은 (주) 경주법주 제조에 사용하는 누룩과 각 지역에서 상업적으로 제조되는 대표적 전통 누룩인 상주곡자, 송학곡자, 진주곡자를 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 배지는 누룩에서 효모 분리와 증식을 위한 배양 배지로 곰팡이 생육을 억제하기 위하여 0.
발암성 ethyl carbamate의 전구물질인 요소의 분해를 촉매하는 urease 생산 효모를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 우리나라 전통 누룩으로부터 약 223주의 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 있는 6 균주를 선별하였다. 분리된 6 균주는 ITS I-5.
효모의 ITS I-5.8S-ITS II 영역의 증폭을 위한 primer는 ITS 1(5'-CATTTAGAGGAACTAAAAGTCG-3')과 ITS 4(5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3') primer를 사용하였다.
데이터처리
염기서열 결과에 대한 서열간의 유사성을 알아보는 상동성 검색은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 운영하는 BLAST를 이용하였고 계통분석을 위한 다중서열정렬(Multiple Sequence Alignment)은 European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)에서 제공하는 Clustal W2를 이용하였다. 그리고 계통 유연관계 분석에서 염기서열의 편집은 BioEdit (version 7.0.9.0) 프로그램을 이용하였으며(23) 근린결합분석(neighbor-joining analysis)에 의한 phylogenetic tree 작성 및 분석에는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA4 version 4.0.2) 프로그램을 이용하였다(24).
이론/모형
PCR 주형으로 사용을 위한 효모 염색체 DNA의 분리는 Kaiser (20)와 Philippsen (21)의 방법에 따라 행하였다. 효모의 ITS I-5.
Polymerase chain reaction (PCR)은 Gene cycleTM(Bio-Rad Co code 9084, Hercules, USA)를 사용하여 일반적인 방법(20)에 따라 총 반응액 양이 50 μL가 되게 하여 행하였다.
Urease 생산 효모의 동정을 위하여 분리 균의 배양학적, 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하여 Kurtzman과 Fell의 The Yeast, A Taxonomic Study (22)에 따라 분류 동정하였다. 효모의 계통분석을 위한 DNA 염기서열은 SolGent 사(Daejeon, Korea)의 Sequencing Service를 의뢰하여 분석하였다.
Urease 활성 측정을 위해 YNB 배지를 사용하여 30℃에서 150 rpm의 속도로 약 24시간 균을 배양한 다음 4℃, 10,000×g로 10분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하였다. Urease 활성측정을 위한 암모니아 함량의 분석은 Weatherburn의 indophenol법(19)을 사용하여 행하였다. A-phenol 시약은 25 g phenol과 0.
효모의 계통분석을 위한 DNA 염기서열은 SolGent 사(Daejeon, Korea)의 Sequencing Service를 의뢰하여 분석하였다. 염기서열 결과에 대한 서열간의 유사성을 알아보는 상동성 검색은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 운영하는 BLAST를 이용하였고 계통분석을 위한 다중서열정렬(Multiple Sequence Alignment)은 European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)에서 제공하는 Clustal W2를 이용하였다. 그리고 계통 유연관계 분석에서 염기서열의 편집은 BioEdit (version 7.
성능/효과
YM 한천배지에서 배양한 후 현미경으로 관찰한 결과 대부분의 세포가 원통형이고 출아에 의한 증식을 하였으며 진균사를 형성하지 않았다. Glucoside 분해능, 전분 유사물질 생성능이 없었고 glucose로부터 산을 생성하지도 않았으나 요소 분해능과 ester 생성능이 있는 것으로 나타났다. 또한 50% glucose와 10% NaCl 농도에서 성장하였고 37℃와 pH 2~10에서도 성장하였다.
0 이상에서는 생육도가 감소하는 경향을 나타내었다. Urease 활성은 2균주 모두 pH 5.0에서 최대치를 나타내었으며 pH가 더 낮아지거나 높아질 경우 효소의 활성이 감소하는 경향을 나타내었다.
0까지 넓은 범위의 산성 조건에서 생육이 매우 양호하여 호산성 효모로 생각된다. Urease 효소의 활성은 PH 5.0에서 최대치를 나타내었고 pH가 감소하거나 높아짐에 따라 활성이 감소하였다.
각각의 누룩을 막자사발에 곱게 갈아 멸균식염수를 적당량 가하여 현탁한 후 0.9% 멸균 식염수로 적당히 희석하였다. 이 희석액 일정량을 0.
8S-ITS II 영역의 염기서열을 분석하고 이 영역의 상동성을 검색한 결과 분리 균주 모두Issatchenkia orientalis ATCC 24210과 유사하게 나타났다. 균주 SHA, SHC, SH10는 I. orientalis ATCC 24210과 100%의 상동성을 나타내었으며 JJA, JJB, JJ22는 422 bp의 염기서열 중 한 개 염기서열의 차이가 있어 99.8%의 상동성을 나타내었다(자료 미제시). 이 염기서열을 토대로 하여 분리된 6개의 균주와 유전적으로 근연관계에 있는 다른 균주와 의 상관관계를 분석한 결과는 Fig.
1과 같다. 균주의 생육 정도는 거의 유사하였으며 urease 활성은 약 20-60 U/mL로 모든 균주가 urease 활성을 나타내었다. 그러나 그 활성의 정도는 균주 간에 차이가 있었으며 특히 SH10 균주가 55.
균주의 생육 정도는 거의 유사하였으며 urease 활성은 약 20-60 U/mL로 모든 균주가 urease 활성을 나타내었다. 그러나 그 활성의 정도는 균주 간에 차이가 있었으며 특히 SH10 균주가 55.2U/mL로서 활성이 가장 높았으며 그 다음으로 JJ22 균주가 52.9 U/mL로서 활성이 높게 나타났다.
5와 같다. 두 균주의 생육은 모두 pH 2-6까지 거의 유사하게 생육이 양호하였으나 pH 7.0 이상에서는 생육도가 감소하는 경향을 나타내었다. Urease 활성은 2균주 모두 pH 5.
또한 6 균주의 ITS I-5.8S-ITS II 영역의 염기서열을 분석하고 이 영역의 상동성을 검색한 결과 분리 균주 모두Issatchenkia orientalis ATCC 24210과 유사하게 나타났다. 균주 SHA, SHC, SH10는 I.
본 연구에서는 분리 균주의 특성을 알아보고자 PCR-RFLP 분석 및 이 영역의 염기서열을 기반으로 한 계통분석을 행하였다. 분리 효모 6 균주의 DNA를 주형으로 하여 ITS I-5.8S-ITS II 영역을 PCR로 증폭한 다음 제한효소 HaeⅢ와 HinfⅠ을 사용하여 처리한 결과 6 균주 모두 동일하게 HaeⅢ 처리에서는 400 bp, HinfⅠ처리에서는 200, 300bp 크기의 동일한 밴드가 나타났다 (Fig. 2).
8% 이상의 염기서열 상동성을 나타내어 유전적으로 매우 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다. 분리 효모 중uresae 활성이 가장 강한 2 균주 JJ22와 SH10을 선정하여 형태학적, 생리학적 특성을 조사한 결과 I. orientalis와 특성이 거의 유사하여 I. orientalis로 동정하였다. 이 균주들은 온도 20-40℃의 넓은 범위에서 생육이 양호하였으며 JJ22의 경우에는 35℃, SH10의 경우에는 30℃에서 urease 활성이 가장 높았다.
우리나라 전통 누룩으로부터 약 223주의 효모를 분리하고 이들 중 urease 활성이 있는 6 균주를 선별하였다. 분리된 6 균주는 ITS I-5.8S-ITS II 영역의 PCR-RFLP 분석 및 계통 분석을 통하여 이 균주 모두가 I. orientalis ATCC 24210과 99.8% 이상의 염기서열 상동성을 나타내어 유전적으로 매우 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다. 분리 효모 중uresae 활성이 가장 강한 2 균주 JJ22와 SH10을 선정하여 형태학적, 생리학적 특성을 조사한 결과 I.
8%의 상동성을 나타내었다(자료 미제시). 이 염기서열을 토대로 하여 분리된 6개의 균주와 유전적으로 근연관계에 있는 다른 균주와 의 상관관계를 분석한 결과는 Fig. 3과 같이 이 균주들이 I. orientalis ATCC 24210과 유전적으로 매우 가까운 위치에 있음을 확인할 수 있었다.
특이적 사실은 균주 JJ22기 L-lysine을 자화한 반면 SH10은 L-lysine을 자화하지 못하여 큰 차이를 나타내었다. 이상의 분자생물학적 계통분석 및 형태학적, 생리학적 특성을 바탕으로 2 균주 모두 I. orientalis로 동정하였다.
탄소원의 발효성으로는 2 균주 모두 glucose,fructose 및 mannose는 발효하였으나 그 외의 탄소원은 발효하지 못하였다. 탄소원의 자화성을 조사한 결과 2 균주 모두 유사하게 나타났으며 특히 sorbitiol의 경우에는 JJ22는 자화하지 못하였으나 SH10 균주는 약하게 자화하는 것으로 나타났다. 질소원 자화성으로는 2 균주 모두 nitrate와 nitrite를 자화하지 못하였으나 cadavarine은 자화하였다.
질소원 자화성으로는 2 균주 모두 nitrate와 nitrite를 자화하지 못하였으나 cadavarine은 자화하였다. 특이적 사실은 균주 JJ22기 L-lysine을 자화한 반면 SH10은 L-lysine을 자화하지 못하여 큰 차이를 나타내었다. 이상의 분자생물학적 계통분석 및 형태학적, 생리학적 특성을 바탕으로 2 균주 모두 I.
균의 생육은 2 균주 모두 온도에 따라 거의 차이가 없어 생육온도의 영역이 넓은 것으로 생각된다. 효소의 활성은 JJ22는 배양온도가 35℃에서 SH10은 30℃일 때 urease 활성이 가장 높게 나타나 두 효모의 효소 생산 최적온도가 일치하지 않음을 알 수 있었다.
후속연구
또 다른 방법은 발효 식품 중의 요소를 분해하기 위한 산성 urease의 효모 내 발현을 들 수 있으나 현재까지 발현에 성공한 예는 거의 없는 실정이다 (34). 따라서 본 연구에서 분리한 urease 생산성 효모 균주는 발효식품에서 요소의 함량을 줄이는데 응용이 가능할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Urease (EC 3.5.1.5)란 무엇인가?
1.5)는 요소를 가수분해하여 암모니아와 이산화탄소의 생성 반응을 촉매하는 효소로서 세균, 효모,곰팡이 등의 미생물과 동물 그리고 고등식물에 널리 분포하고 있다(1-3). 1926년 처음으로 이 효소가 발견된 이후 다양한 생물체에서의 존재가 밝혀지고 있다.
Urease가 처음 발견된 시기는 언제인가?
5)는 요소를 가수분해하여 암모니아와 이산화탄소의 생성 반응을 촉매하는 효소로서 세균, 효모,곰팡이 등의 미생물과 동물 그리고 고등식물에 널리 분포하고 있다(1-3). 1926년 처음으로 이 효소가 발견된 이후 다양한 생물체에서의 존재가 밝혀지고 있다. Urease를 생산하는 미생물로는 Proteus, Klebsiella, Morganella, Providencia spp.
Urease를 생산하는 미생물은 무엇이 있는가?
1926년 처음으로 이 효소가 발견된 이후 다양한 생물체에서의 존재가 밝혀지고 있다. Urease를 생산하는 미생물로는 Proteus, Klebsiella, Morganella, Providencia spp.를 포함하는 장내세균 일부와 Helicobacter pylori,Proteus vulgaris, Ureaplasma urealyticum, Lactobacillusfermentum, Arthrobacter mobilis, Pseudomonas aeruginosa,Canavalia ensiformis, Rhizobium meliloti 등의 세균 및 Cryptococcus spp. 등의 효모가 알려져 있다(1,2,4-7).Helicobacter pylori의 urease를 이용하여 암모니아를 생산함으로써 위산을 중화하여 성장에 필요한 환경을 만드는 것으로 알려져 있어 이 병원균의 진단을 위하여 urease의 존재 유무를 조사하기도 한다(8).
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