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문제 정의
- 본 논문에서는 전신 X선 조사 전 백삼 추출물과 동 충하초 추출물의 경구투여가 ICR mice 간에서의 방사선 장해에 대한 방사선 방호효과를 구명하기 위하여 방사선방호제인 glutathione 함량변화에 미치는 영향을 예측 가능한 관계에 관련된 더 많은 정보를 얻기 위하여 전신 X선 조사 후 2주간 연구했다.
제안 방법
- 5)700 ㎕, 6 mM DTNB용액 100 ㎕, 200 ㎕의 측정시료를 혼합한 반응액을 30 ℃로 조절되는 thermostatted cuvette holder에서 4분간 안정화시킨 다음 412 nm에서 흡광도 변화를 1분간 측정하였다. GSSG의 정량은 GSH를 제거하기 위해 측정시료와 acrylonitrile을 혼합하여 60분간 방치한 후 total GSH와 동일한 조건에서 GR(200 kU/ℓ)용액을 20 ㎕로 증가하여 반응시커 흡광도의 변화를 측정하였다. GSH의 함량은 다음 식에 의해서 계산하였다.
- ICR종 수컷 생쥐를 동충하초 투여군, 백삼 투여군, 방사선 조사군, 대조군으로 각각 분류하여 동충하초 투여군(EF+Rad), 백삼투여군(WG+Rad)은 Linac 6Mev X선 조사 전에 백삼은 7일간(150 mg/kg/day), 동충하초는 7일간(200 mg/kg/day)을 각각 경구 투여하였고, 방사선 조사군(Rad)은 6Mev X선을 5 Gy (1.01 Gy/min) 선량으로 조사하였으며, 대조군(Co)은 0.1 ml의 생리적 식염수를 투여하였다. 각각의 실험군을 통하여 생쥐간 조직에서의 환원형 glutathione와 산화형 glutathione(GSSG)의 함량 변화를 조사한 결과 아래와 같다.
- Linac 6Mev X선을 생쥐에 전신조사로 유도된 생쥐 간의 장해에 대한 백삼과 동충하초추출물의 방사선방호효과를 방호제인 glutathione(GSH) 함량 변화를 통하여 실험적 연구를 하였다.
- 실험 디자인은 [Table 1]과 같다. [Table 1]과 같이 실험 동물로 20마리를 1군으로 하여 대조군(Con), 동충하초 투여군(EF+Rad), 방사선조사군(Rad), 백삼투여후 방사선 조사군(WGE+Rad)등으로 4개 군으로 분류하였다.
- 대조군 : 생리적 식염수(0.1ml)를 경구투여 했다.
- 방사선 방호효과를 검토하기 위하여 [Table] 1과같이 실험동물인 생쥐 5마리를 1군으로 하여 대조군(Con), 방사선조사군(Rad), 백삼(WG+Rad) 투여군, 동충하초(EF+Rad) 투여군 등 총 4개 군으로 분류하였다. 대조군, 방사선조사군은 증류수 0.1 ㎖/day를 경구 투여하였고, 백삼투여군은 방사선조사 전에 7일 동안 150 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다.
- 대조군과 6Mev X선 조사 후 4시간, 24시간, 7일, 14일에 동충하초 투여군(EF+Rad) , 백삼 추출물 투여군 (WG+Rad) 과 방사선조사군(Rad)을 각각의 실험군당 20마리씩 16시간 절식시킨 다음 경추탈구로 희생 시키고 간을 적출 한 후 얼음결정이 있는 상태의 생리식염수에 넣어 세절하고 세 번 수세하여 혈액을 제거하고 무게를 측정하였다.
- 동충하초투여군 : 5 Gy의 방사선조사 전 7일 동안에생리적 식염수(0.1ml)와 동충하초를 경구투여 했다.
- 또한, 동충하초 투여군은 방사선조사 전에 7일 동안 200 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다. 방사선조사는 6Mev X선원을 이용하여 5.
- 1 ml의 농도로 생리학적 식염수에 용해했고 체중 15 mg/100 g의 양에서 쥐에 경구 투여했다. 또한, 동충하초투여군(EF+Rad)은 방사선 조사 전에 7일 동안 200 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다. 각 실험군은 보통 20마리의 쥐로 구성되었다.
- 방사선 방호효과를 검토하기 위하여 [Table] 1과같이 실험동물인 생쥐 5마리를 1군으로 하여 대조군(Con), 방사선조사군(Rad), 백삼(WG+Rad) 투여군, 동충하초(EF+Rad) 투여군 등 총 4개 군으로 분류하였다. 대조군, 방사선조사군은 증류수 0.
- 방사선조사군 : 5 Gy의 방사선조사 전 7일 동안에 생리적 식염수(0.1ml)를 경구투여 했다.
- 또한, 동충하초 투여군은 방사선조사 전에 7일 동안 200 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다. 방사선조사는 6Mev X선원을 이용하여 5.0 Gy(1.01 Gy/min)의 선량을 1회 전신조사 하였다.
- 이 반응을 촉매하는 효소인 GPx(glutathione peroxida se) 가 2분자의 GSH와 공유결합 할 수 있도록 유도하여 1분자의 GSSG가 생성하게 한다. 백삼과 동충하초를 방사선조사 전에 경구투여 할 경우 과산화수소로부터 생체 내에 조직을 보호하려는 백삼과 동충하초의 방사선 보호효과 등을 검토하기 위하여 GSSG의 함량변화를 측정하였다.
- 백삼과 동충하초를 방사선조사 전에 경구투여 할경우 활성산소로부터 생체조직을 보호하는 인삼과 동충하초의 방사선 보호효과를 검토하기 위하여 GSSG/total GSH의 비율 변화를 측정하였다.
- 백삼투여군 : 5 Gy의 방사선조사 전 7일 동안에 생리적 식염수(0.1ml)와 백삼를 경구투여 했다.
- 생리 식염수을 투여한 대조군(Con)과 방사선을 조사한 방사선 조사군(Rad), 방사선 조사전 백삼을 투여한 투여군(WGE+Rad), 동충하초투여군(EF+Rad)으로 각 실험군을 분류하여 실험을 실시한 결과로 활성산소를 소거하는데 작용하는 방사선 방호제인 glutathione의 함량변화 등을 아래와 같이 얻게 되었다.
- 수컷 쥐 (무게 25～30 g)는 균등한 조사야 20㎝×20㎝ (선량율 1.01 Gy/min)로 Linac 6Mev X선 치료 장치(NEC model)을 이용하여 각각 5 Gy씩 실온에서 전신 조사 했다.
- 원심분리기(Beckman J2-2401PC), 마쇄기(wheaton USA), 분광광도계(Shimadzu UV-2401PC), 초저온 냉동기(Ilsin DF9007), 증류수 제조기(MILLIPORE Milli -Q), 제빙기(BREMA HB802), 저울(METTLER AT201), 초음파 마쇄기(BRANSON 3210) 및 항온수조(EYELA, SB-9), Linac 6Mev X선 치료장치(NEC model)등을 사용하여 실험하였다.
- 인삼 추출물는 5.5 mg/0.1 ml의 농도로 생리학적 식염수에 용해했고 체중 15 mg/100 g의 양에서 쥐에 경구 투여했다. 또한, 동충하초투여군(EF+Rad)은 방사선 조사 전에 7일 동안 200 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다.
- 쥐는 약 50±10 %의 상대습도와 실온 20±2℃, 12시간 명암주기의 우리에서 시판되는 생쥐용 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였으며, 이와 같은 조건에서 1주일간 적응시킨 후 체중이 25-30 g의 생쥐만을 선별하고 각 실험군으로 분류하여 사용하였다.
대상 데이터
- 4 주령된 ICR계 수컷 생쥐를 Shizuoka 실험동물센터 (Shizuoka, Japan)로 부터 구입하였다. 쥐는 약 50±10 %의 상대습도와 실온 20±2℃, 12시간 명암주기의 우리에서 시판되는 생쥐용 사료와 물을 자유롭게 먹게 하였으며, 이와 같은 조건에서 1주일간 적응시킨 후 체중이 25-30 g의 생쥐만을 선별하고 각 실험군으로 분류하여 사용하였다.
- Glutathione reductase, β-NADPH, Phosphoric acid, potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) 등은 Sigma로부터 구입했다.
- 또한, 동충하초투여군(EF+Rad)은 방사선 조사 전에 7일 동안 200 ㎎/㎏/day을 쥐에 경구 투여하였다. 각 실험군은 보통 20마리의 쥐로 구성되었다. 실험 디자인은 [Table 1]과 같다.
- 동충하초추출물인 Paecilomyces japonica(누에번데기)는 임실동충하초 연구소에서 재배되어 건조시키고 분발상태로 제공받았으며, 5 g를 내열용기에 넣고 물을 채워 100 ㎖로 한 후 고압증기(압력: 1.2 ㎏/day㎠)로 120 ℃에서 6시간 추출하였다. 추출물을 냉각하고 여과 한 후 여액에 물을 이용하여 100 ㎖로 정용하여 동충하초 추출물로 사용했다.
- 백삼 뿌리의 추출물은 일화(주) 중앙연구소로부터 얻었고 실험동안에 섭씨 4도에서 저장했다. 인삼추출물을 0.
데이터처리
- 모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험군별로 평균차이가 있는가를 검증하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 수행하였으며, 투여군 간의 유의성은 Student t-test을 이용하여 상호유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 간조직에서의 total glutathione(GSH + GSSG)와 GSSG함량은 Tietze 측정법을 변형한 Griffith(1980)방법에 의해 측정하였다.
성능/효과
- 1. 동충하초투여군과 백삼 투여군에서 방사 선 조사군보다 유의성 있게 glutathione 함량이 증가 하였고 산화형 glutathione (GSSG)의 함량은 유의성 있게 감소하였다.
- 2. 동충하초투여군과 백삼투여군에서 방사 선 조사군 보다 산화형 glutathione (GSSG)의 함량과 총 glutathione함량 비율은 유의성 있게 감소하였다.
- [Table 3]와 [Fig 2]에서 보는 바와 같이 백삼과 동충하초를 방사선조사 전에 경구투여 하여 GSSG의 함량변화를 측정한 결과, 방사선조사군(Rad)의 GSSG의 함량변화는 4시간째를 제외한 1일, 7일 및 14일째 모두 대조군에 비하여 유의성(p<0.01) 있게 함량이 증가하였다.
- 01) 있게 감소함을 보였다. 또한, 백삼과 동충하초 투여군 사이의 상호 유의성을 조사한 결과 백삼투여 군이 1일, 7일 및 14일째 동충하초투여군에 비하여 비율이 증가함을 보였으나 유의성은 없었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 백삼과 동충하초 투여군은 방사선조사군에 비하여 모두 GSSG/total GSH의 비율을 감소시켰으며, 백삼과 동충하초 투여군 사이의 상호 유의성은 없었다.
- 또한, 백삼과 동충하초 투여군의 경우 4시간, 1일째에는 GSSG의 함량이 대조군과 거의 비슷한 함량 수준을 보였으며, 특히 7일째, 14일째 백삼투여군 과 동충 하초 투여군에서 모두 함량 증가를 보였다.
- 또한, 백삼과 동충하초 투여군의 경우 4시간째를 제외한 1일, 7일 및 14일째에 모든 투여군에서 대조군에 비하여 그 함량이 유의성(p<0.01)있게 감소하였으나, 방사선조사군을 대조군으로 하여 인삼과 동총하초 투여군의 상호 유의성은 모든 투여군에서 방사선조사군에 비하여 GSH의 함량이 유의성(p<0.01) 있게 증가하였다.
- 방사선조사군(Rad)을 대조군으로 하여 백삼 투여군과 동충하초 투여군의 상호 유의성을 조사한 결과 4시간, 1일째에는 GSSG의 함량 수준이 방사선 조사군보다 감소하였으나 유의성은 없었으며, 7일, 14일째에는 유의성(p<0.01) 있게 감소하였다.
- 방사선조사군(Rad)을 대조군으로 하여 백삼과 동충하초 투여군의 상호 유의성을 조사한 결과 모든 투여군에서 방사선조사군에 비하여 그 비율이 유의성 (p<0.01) 있게 감소함을 보였다.
- 방사선조사로 인해 생성된 활성산소에 대한 백삼과 동충하초의 방호효과를 알아보기 위하여 인삼과 동충하초를 전 처리한 다음 방사선을 조사한 후 GSH의 함량을 측정한 결과, [table 2]과 [Fig 1]에서 보는 바와 같이 방사선조사군의 GSH 함량이 대조군에 비해 유의성(p<0.01)있게 감소하였다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 GSH의 함량 증가는 백삼과 동충하초의 활성성분이 GSH의 생합성효소의 활성을 증가시키기보다 glutathione reductase 효소를 활성화함으로써 GSSG가 GSH로 환원되어 효능을 나타내었기 때문이라고 여겨진다.
- 또한, 백삼과 동충하초 투여군 사이의 상호 유의성을 조사한 결과 백삼투여 군이 1일, 7일 및 14일째 동충하초투여군에 비하여 비율이 증가함을 보였으나 유의성은 없었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 백삼과 동충하초 투여군은 방사선조사군에 비하여 모두 GSSG/total GSH의 비율을 감소시켰으며, 백삼과 동충하초 투여군 사이의 상호 유의성은 없었다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 백삼과 동충하초는 방사선조사로 GSH의 함량 감소를 유의성 있게 억제하여 생체 내에 방호작용을 원활하게 할 것으로 판단된다.
- 01) 있게 증가하였다. 인삼 투여군과 동충하초 투여군 사이의 GSH 함량에서 모두 상호 유의성 있는 결과는 보이지 않았다.
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