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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 동물 뼈에서 추출한 HA 분말 및 인공합성으로 제조한 HA 분말을 사용하여 HA 소결체를 제조한 다음 생체 내부 환경과 유사한 in vitro 조건에서 조골세포와 HA 재료와의 부착능 실험을 통하여 생체친화성을 비교해 보고자 하였다.
제안 방법
- human osteoblast-like cell line인 MG-63 세포는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 내에서 배양되었으며, 배양은 37℃의 온도에서 CO2가 5% 공급되는 환경조건에서 실시하였다. DMEM 배양액에는 10% fetal bovine serum (16000-044, Gibco)와 항생제로서 1%(v/v) antibiotic antimycotic solution(15240-0620, Gibco)을 첨가하였으며, completed media는 2일에 한 번씩 정기적으로 교체하였다.
- HA 소결체의 세포반응성 실험을 위해서 우선 소결체의 표면을 다이아몬드 정반에서 1 µm까지 연마한 다음, Autoclave 내에서 121℃로 멸균하였다.
- MG-63 세포는 단위면적 1 cm2당 약 6 × 104개 정도일때 거의 포화된다고 보고된바 있는데,15) 단위 면적당 세포 개체 수 및 세포의 doubling time을 고려하여 각각 1, 3, 5일 되는 시점에 증식 실험을 수행하였다.
- 67이고 순수한 하이드록시아파타이트 상을 갖는 분말이었다. 각각의 분말을 일축가압으로 성형하여 실린더형 성형체를 제조한 다음, 220 MPa의 압력으로 정수압성형을 행하여 고밀도의 성형체를 제조하였다. 소결은 수증기 분위기에서 1200℃의 온도로 1시간 동안 행하였으며, 소결 후 밀도분석, 상분석, 미세 구조 분석을 행하였다.
- 이것으로 미루어 소뼈는 열처리 시 600℃까지는 대부분의 유기물의 분해가 이루어지고, 분말 내에 잔류된 일부 탄소도 800℃에서 대부분 분해가 끝나 모두 제거되는 것으로 판단되었다. 따라서 본 실험에서는 하소 온도를 800℃로 정하였으며, 하소시간은 1시간으로 고정하여 하이드록시아파타이트 분말을 최종적으로 제조하였다.
- 시편 위에서 세포의 성장 및 증식을 알아보기 위하여 세척한 시편을 24well에 옮긴 후 4% Paraformaldehyde를 2시간동안 반응 후 제거하고, 그런 다음 50, 60, 70, 80, 90, 100% 알콜에 10분씩 시편을 침적시켜 4% paraformaldehyde를 세척하였다. 마지막으로 isoamyl acetate 에 3시간 이상 담근 후 실온에서 건조시켜 주사전자현 미경(SEM, H-4800, HITACHI)으로 관찰하였다. 조골세포의 성장은 MTS assay로 측정하였는데, 세척된 시편 위에 MTS 시약을 분주한 다음 96 well plate로 옮긴 후 microplate reader를 이용, 490 nm에서 흡광도를 측정하여 각 조건에 따른 상대적인 부착능을 확인하였다.
- 수세된 소뼈는 건조기 내에서 80℃로 건조하여 수분을 제거하였고, 소 뼈 내부에 잔류하는 유기물을 완전히 제거하기 위해 고온으로 하소시키는 방법을 통하여 분말을 제조하였다. 소 뼈의 열분해 거동을 관찰하기 위하여 1200℃의 온도 까지 DTA-TG 분석과 육안관찰에 의한 색상분석을 행하였으며, 이들 실험결과를 바탕으로 소뼈의 분쇄물을 800℃에서 1시간 동안 하소하여 최종적인 HA 분말을 제조하였다. 하소된 분말을 48시간 동안 attritor 볼 밀을 한 후 80℃의 온도에서 건조하였으며, 하소된 분말의 상분석은 X선 회절분석을 통하여 수행하였다.
- 각각의 분말을 일축가압으로 성형하여 실린더형 성형체를 제조한 다음, 220 MPa의 압력으로 정수압성형을 행하여 고밀도의 성형체를 제조하였다. 소결은 수증기 분위기에서 1200℃의 온도로 1시간 동안 행하였으며, 소결 후 밀도분석, 상분석, 미세 구조 분석을 행하였다.
- 수세된 소뼈는 건조기 내에서 80℃로 건조하여 수분을 제거하였고, 소 뼈 내부에 잔류하는 유기물을 완전히 제거하기 위해 고온으로 하소시키는 방법을 통하여 분말을 제조하였다. 소 뼈의 열분해 거동을 관찰하기 위하여 1200℃의 온도 까지 DTA-TG 분석과 육안관찰에 의한 색상분석을 행하였으며, 이들 실험결과를 바탕으로 소뼈의 분쇄물을 800℃에서 1시간 동안 하소하여 최종적인 HA 분말을 제조하였다.
- 세포 배양후 일정 시간이 지나면 배양액을 제거하고, 인산완충용액(dulbecco's phosphate buffer saline, 21600-010, Gibco)을 첨가한 다음, 다시 제거하는 과정으로 반복하여 세척하였다. 시편 위에서 세포의 성장 및 증식을 알아보기 위하여 세척한 시편을 24well에 옮긴 후 4% Paraformaldehyde를 2시간동안 반응 후 제거하고, 그런 다음 50, 60, 70, 80, 90, 100% 알콜에 10분씩 시편을 침적시켜 4% paraformaldehyde를 세척하였다. 마지막으로 isoamyl acetate 에 3시간 이상 담근 후 실온에서 건조시켜 주사전자현 미경(SEM, H-4800, HITACHI)으로 관찰하였다.
- 연마된 HA 표면에 MG-63 cell을 well 당 1 × 104 개를 분주시킨 다음, 공기 중 5%의 이산화탄소를 포함하고 37℃로 유지시킨 인큐베이터 내에서 1, 3, 5일 증식 실험을 수행하였으며, 그 결과를 SEM으로 고찰하여 Fig. 6과 Fig. 7에 나타내었다.
- 인공합성된 HA 분말 및 소 뼈에서 추출한 HA 분말을 사용하여 소결체를 제조한 다음, 조골세포인 MG-63 cell의 증식 및 분화실험을 통하여 출발원료에 따른 HA 재료의 생체 친화성을 고찰하였다. 인공합성 HA와 소뼈로부터 추출된 HA 분말을 사용하여 제조된 소결체는 분말 특성의 차이에 의해 입자크기, 밀도, 상 조성에서 큰 차이를 나타내었다.
- 마지막으로 isoamyl acetate 에 3시간 이상 담근 후 실온에서 건조시켜 주사전자현 미경(SEM, H-4800, HITACHI)으로 관찰하였다. 조골세포의 성장은 MTS assay로 측정하였는데, 세척된 시편 위에 MTS 시약을 분주한 다음 96 well plate로 옮긴 후 microplate reader를 이용, 490 nm에서 흡광도를 측정하여 각 조건에 따른 상대적인 부착능을 확인하였다.
- 소 뼈의 열분해 거동을 관찰하기 위하여 1200℃의 온도 까지 DTA-TG 분석과 육안관찰에 의한 색상분석을 행하였으며, 이들 실험결과를 바탕으로 소뼈의 분쇄물을 800℃에서 1시간 동안 하소하여 최종적인 HA 분말을 제조하였다. 하소된 분말을 48시간 동안 attritor 볼 밀을 한 후 80℃의 온도에서 건조하였으며, 하소된 분말의 상분석은 X선 회절분석을 통하여 수행하였다.
대상 데이터
- human osteoblast-like cell line인 MG-63 세포는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 내에서 배양되었으며, 배양은 37℃의 온도에서 CO2가 5% 공급되는 환경조건에서 실시하였다.
- 세포 반응성 실험에 사용된 MG-63 세포는 조골세포의 세포배양 실험을 통하여 얻었다. human osteoblast-like cell line인 MG-63 세포는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 내에서 배양되었으며, 배양은 37℃의 온도에서 CO2가 5% 공급되는 환경조건에서 실시하였다.
- 천연 HA 원료 물질로는 음식점에서 발생되는 소뼈를 수거하여 사용하였다. 수거된 소뼈는 방해 요소인 유기물과 염분 등을 제거하기 위하여 일차적으로 물로 세척하고 칫솔로 시료 표면의 큰 유기물들을 제거하였다.
- 천연 원료로부터 제조된 분말의 생체친화성을 비교 고찰하기 위한 인공합성 원료로는 시중에서 상용 HA 분말을 구입하여 출발물질로 사용하였는데 이 분말은 일본 신요사에서 침전법을 통하여 제조된 분말로 입자크기가 20-50 nm였으며, Ca/P비는 1.67이고 순수한 하이드록시아파타이트 상을 갖는 분말이었다. 각각의 분말을 일축가압으로 성형하여 실린더형 성형체를 제조한 다음, 220 MPa의 압력으로 정수압성형을 행하여 고밀도의 성형체를 제조하였다.
성능/효과
- 그러나 600℃ 이후에는 미세한 무게 감소만 있을 뿐 커다란 무게 감소가 관찰되지 않 았다. 500-1200℃의 온도 구간에서 1시간 동안 각각 하소하여 하소온도에 따른 소뼈의 색상을 육안으로 살펴본 결과(Table 1), 500℃에서는 갈색, 600℃에서는 회색, 700℃에서는 밝은 회색, 그리고 800℃ 이상에서는 모두 흰색을 나타내었다.
- X-선 회절 분석 결과 2θ 가 42.5도 근처에서 MgO를 나타내는 작은 피크가 관찰되었으며, 이를 제외하고는 모두 HA 특성 피크를 나타내었다.
- 소결밀도가 비교적 높아 표면에는 적은 양의기공만 존재하였다. X-선 회절에 의한 소결체의 상 분석 결과, 분말의 XRD와 유사한 특성을 나타내었으며, 소결시 TCP로의 상분해나 상전이는 일어나지 않는 것을 알수 있었다.
- 인공합성 HA와 소뼈로부터 추출된 HA 분말을 사용하여 제조된 소결체는 분말 특성의 차이에 의해 입자크기, 밀도, 상 조성에서 큰 차이를 나타내었다. 그러나 두 소결체에서 세포의 성장 및 증식 실험을 수행한 결과 생체 친화성 측면에서는 거의 유사한 특성을 나타내었다. 증식실험 초기에는 인공합성 HA 소결체에서 세포의 증식이 다소 잘 이루어졌지만 증식 실험 후 5일이 지난 시편에서는 세포의 증식이 거의 동일한 수준으로 유지되었다.
- 7에 나타내었다. 그림에서 보듯이 MG-63 세포는 두 시편 위에 잘 부착되어 성장하였는데, 둥근 형태의 핵으로 강조되는 세포들은 별 모양으로 잘 뻗어 자라는 모습이며, 시간이 지남에 따라 둥근형태의 핵이 선명하게 드러날 뿐 아니라 세포질이 끼리 잘 연결되어 있음을 알 수 있었다.
- 증식실험 초기에는 인공합성 HA 소결체에서 세포의 증식이 다소 잘 이루어졌지만 증식 실험 후 5일이 지난 시편에서는 세포의 증식이 거의 동일한 수준으로 유지되었다. 따라서 소 뼈로부터 제조된 HA의 경우에도 기존의 인공합성 HA와 마찬가지로 우수한 생체친화성을 갖고 있는 것으로 판단되었다.
- 하이드록시아파타이트 표면에 부착되는 세포의 양은 보통 표면의 형상과 비표면적, 그리고 화학적 조성등에 따라 변할 수 있는데, 기공의 양보다는 표면적이나 표면 거칠기에 더 큰영향을 받는 것으로 알려져 있는데,22) 똑같은 조성의 하이드록시아파타이트에서 표면 거칠기가 다른 경우 세포의 부착 및 증식된 양이 달라졌는데, 표면거칠기가 증가할수록 세포의 부착량이 증가하였다. 본 실험의 경우 인공합성 HA의 경우 배양 초기 부분적인 입계용해가 진행되면서 표면거칠기가 커지고, 이에 따라 세포의 초기 부착능이 다소 증가한 것으로 예측된다. 표면 거칠기 등 물리적 특성 외에도, 표면의 조성이나 용해특성에 따라 세포의 부착능과 증식량이 달라질 수 있는데, 천연 뼈로부터 만들어진 하이드록시아파타이트의 경우 배양 실험 시 표면의 제타 전위가 음으로 나타나 세포의 부착이나 증식을 촉진하는 것으로 보고된 바 있다.
- 이에 따라 연마한 시편의 표면에는 그림에서 보여주듯이 많은 연결 기공이 존재하였다. 소결된 시편의 상분석 결과, 앞서의 경우와 마찬가지로 상분해시 나타나는 TCP상이나 CaO 상은 관찰되지 않았는데, 분말의 XRD와 같이 HA 상이 대부분이었고, 이외에도 MgO의 미세 피크가 관찰되었다.
- 표면 유기물을 제거한 소뼈는 노란색을 나타내었는데, 열처리 온도가 증가함에 따라 색상이 점차 변화하였다. 열처리 온도에 따른 소 뼈의 열분해 특성을 알아보기 위하여 TG/DTA 분석을 행한 결과(Fig. 1), 250℃에서부터 600℃ 까지 유기물의 연소에 의한 발열피크와 중량감소가 나타났으며, 특히 280℃ 및 430℃부근에서 큰 발열 피크가 관찰되었다. 한편 중량분석 결과를 보면, 100℃까지는 수분의 증발에 따른 소량의 중량 감소를 보였고, 250-600℃ 사이에서는 유기물의 분해에 의해 급격한 무게 감소를 보이고 있다.
- 이러한 결과로 미루어 출발원료와 관계없이 인공합성 HA와 소뼈로부터 제조된 HA는 인산칼슘계 세라믹스로 이루어져 있기 때문에 생체친화성이 크고, 이로 인하여 세포의 부착 및 증식이 잘 이루어진 것으로 보이며, 이것으로 미루어 본 실험에서 제조된 HA 소결체 내에는 세포에 대한 독성이 없으며, 생체 친화성이 큰 것으로 확인되었다. 두 종류의 시편 모두 세포의 부착력은 비교적 높게 나타났지만, 부착형태 및 퍼짐 형상은 약간의 차이를 보였는데 그 차이는 미세하였다.
- 두 종류의 시편 모두 세포의 부착력은 비교적 높게 나타났지만, 부착형태 및 퍼짐 형상은 약간의 차이를 보였는데 그 차이는 미세하였다. 전체적으로 인공합성 HA와 소뼈로부터 제조된 HA 시편의 표면에서는 증식 시간이 증가함에 따라 MG-63 세포가 수 및 퍼짐 현상이 증가하였다. 특히 5일이 지난 후에는, 세포의 성장으로 인하여 HA 표면에 세포가 밀집되어 있는 것이 관찰되었다.
- 그러나 두 소결체에서 세포의 성장 및 증식 실험을 수행한 결과 생체 친화성 측면에서는 거의 유사한 특성을 나타내었다. 증식실험 초기에는 인공합성 HA 소결체에서 세포의 증식이 다소 잘 이루어졌지만 증식 실험 후 5일이 지난 시편에서는 세포의 증식이 거의 동일한 수준으로 유지되었다. 따라서 소 뼈로부터 제조된 HA의 경우에도 기존의 인공합성 HA와 마찬가지로 우수한 생체친화성을 갖고 있는 것으로 판단되었다.
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