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제안 방법
- PCR은 10 µL의 반응액에 20-30 ng의 genomic DNA를 주형으로 각 dNTP 0.25 mM, 0.5 unit의 I-starTaq polymerase (Intron Bio, Korea), 1X PCR 완충 용액과 좌위별 특정 농도의 primer 쌍을 포함시켰으며, GeneAmp PCR system 9700 증폭기(Applied Biosystems, Foster city, CA)를 이용하여 수행하였다.
- 먼저 각각의 마커들의 유전자형을 Excell file을 이용하여 worksheet로 일괄 정리하여 데이터베이스화하였다. 각 검체에 대해서 첫 번째와 두번째 컬럼에 각각 종(species)과 검체의 정보를 입력하였으며, 이어서 각 8개의 마커에 대한 유전자형을 입력 하였다. 복합유전자형의 정보를 2차원 바코드 형태로 변환 하는 출력 프로그램을 제작하였으며, 바코드의 출력은 호환 불러오기하여 연결된 PF8t 바코드 전용 프린터로 실시하였다.
- (2012)의 국내에서 채집된 야생 춘란의 결과를 따랐다. 고정된 고유 품종(개체) 별 복합 유전자형(combined genotype)으로부터 각 개체를 구분할 수 있는 식별능은 결합변별력(combined power of discrimination: CPD)으로 나타내었는데, CPD는 각 품종에 대한 각각의 SSR 좌위의 유전자형의 예상 출현빈도값을 곱하여 계산하였다(PowerStats V1.2, http://www.promega.com) (Tereba, 1999).
- 2). 따라서 본 연구에서는 각각 다른 품종으로 고정된 C. goeringii 40개체에 대한 SSR 8좌위의 대립유전자형을 결정하고 유전적 다형성과 개체식별력의 분석은 multiplex PCR 방법으로 수행하였다 (Table 3). 각 SSR 좌위별 대립유전자는 SSR DNA ID의 데이터베이스 구축, 상호 비교 및 검증이 가능하게 사람에게 법의학적으로 적용되는 방법인 SSR motif의 반복 횟수를 기준으로 명명하였다(Bär et al.
- 본 연구에서 확립한 8개의 SSR 마커를 이용하여 춘란의 복합 유전자형 결과를 토대로 부여한 SSR DNA ID를 2차원 바코드로 표현하는 시스템을 개발하였다. 먼저 각각의 마커들의 유전자형을 Excell file을 이용하여 worksheet로 일괄 정리하여 데이터베이스화하였다. 각 검체에 대해서 첫 번째와 두번째 컬럼에 각각 종(species)과 검체의 정보를 입력하였으며, 이어서 각 8개의 마커에 대한 유전자형을 입력 하였다.
- 각 검체에 대해서 첫 번째와 두번째 컬럼에 각각 종(species)과 검체의 정보를 입력하였으며, 이어서 각 8개의 마커에 대한 유전자형을 입력 하였다. 복합유전자형의 정보를 2차원 바코드 형태로 변환 하는 출력 프로그램을 제작하였으며, 바코드의 출력은 호환 불러오기하여 연결된 PF8t 바코드 전용 프린터로 실시하였다. 2차원 바코드의 인쇄는 작은 부착식 라벨지(25mm × 30 mm) 상에 12 mm × 12 mm의 크기로 인쇄되게 하여, 해당 품종이 심겨진 화분에 부착이 용이하도록 하였다(Fig.
- 본 연구는 처음으로 춘란의 고정된 40 품종으로부터 SSR 좌위의 유전자형을 분석하고, 얻어진 복합 유전자형으로부터 2차원 바코드를 제작하였다. 특히 8좌위의 분석을 위해 동시증폭 PCR법(multiplex PCR)을 개발함으로서, 검체별 분석 시간을 단축함은 물론, 소량의 검체로도 모든 좌위의 유전자형을 결정할 수 있게 하였다.
- 본 연구에서 확립한 8개의 SSR 마커를 이용하여 춘란의 복합 유전자형 결과를 토대로 부여한 SSR DNA ID를 2차원 바코드로 표현하는 시스템을 개발하였다. 먼저 각각의 마커들의 유전자형을 Excell file을 이용하여 worksheet로 일괄 정리하여 데이터베이스화하였다.
- 본 연구에서는 C. goeringii의 고정된 40품종을 대상으로 지난 연구를 통해 분리한 높은 다형성의 8개 SSR 좌위(CG409, CG415, CG709, CG722, CG787, CG1023, CG1210, CG1281)를 multiplex PCR 방법으로 동시증폭한 후 복합 유전자형을 결정하고(Hyun et al., 2012), 각 개체를 매우 높은 정확도로 식별할 수 있는 유전 정보를 가지는 2차원 바코드를 제작하였다.
- 아울러, 각 검체유전정보를 담고 있는 출력된 2차원 바코드는 DS6608 전용 바코드 인식 스캐너 (Symbol Technol., USA)를 이용하여 다시 컴퓨터에 정보를 재입력할 수 있도록 하였다. 즉, 스캐너를 통해 읽혀진 정보는 text file로 옮겨지는데, 이 file에는 본래 데이터베이스를 작성할 때 입력된 검체별 종 및 검체 ID와 8 SSR 좌위의 유전자형 정보가 모두 포함된다(Fig.
- 2차원 바코드는 작은 크기의 부착식 라벨지(25mm × 30mm)에 12mm × 12mm의 크기로 인쇄하여 사용할 수 있게 하였다. 아울러, 유전정보를 담고 있는 출력된 2차원 바코드는 DS6608 전용 바코드 인식 스캐너 (Symbol Technol., Holtsville, NY, USA)를 이용하여 다시 컴퓨터에 정보를 재입력할 수 있도록 하였다. 즉, 스캐너를 통해 읽혀진 정보는 text file로 옮겨지며, 이를 다시 Excel file로 변환하여 데이터 처리를 할 수 있도록 하였다.
- , Holtsville, NY, USA)를 이용하여 다시 컴퓨터에 정보를 재입력할 수 있도록 하였다. 즉, 스캐너를 통해 읽혀진 정보는 text file로 옮겨지며, 이를 다시 Excel file로 변환하여 데이터 처리를 할 수 있도록 하였다.
- PCR 조건은 94℃ 에서 2분간 예비변성시킨 후 95℃에서 30초 변성, 58℃에서 45초 결합, 72℃에서 1분 신장을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 60분간 신장시켰다. 증폭된 형광 표지된 PCR 산물은 Liz-500을 internal standard로 사용하여 ABI 3130 automatic sequencing analyzer (Applied Biosystems)로 분리한 후 Genemapper(NT, Ver. 4.1)로 유전자형을 분석하였다.
- kr). 춘란으로부터 절취한 조직은 액체질소를 이용하게 막자사발에서 분말로 파쇄한 후, 총 DNA는 Plant-easy genomic DNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 분광광도계(Smart Spec 3000, BIORAD, USA)로 정량한 후 -20℃에서 보관하였다.
- 춘란의 microsatellite 분석을 통하여 얻은 8좌위에 대한 복합유전자형의 정보를 2차원 바코드(barcode) 형태로 변환하는 출력 프로그램을 제작하였다(한국전자인식, http://www .keid.co.kr). 프로그램은 Excel 프로그램(Microsoft Co, USA)을 이용해 정해진 양식으로 각 좌위의 유전자형 데이터를 입력한 후, 제작된 프로그램으로 호환 불러오기하여 연결된 PF8t 바코드 전용프린터(Intermec Technol.
- 본 연구는 처음으로 춘란의 고정된 40 품종으로부터 SSR 좌위의 유전자형을 분석하고, 얻어진 복합 유전자형으로부터 2차원 바코드를 제작하였다. 특히 8좌위의 분석을 위해 동시증폭 PCR법(multiplex PCR)을 개발함으로서, 검체별 분석 시간을 단축함은 물론, 소량의 검체로도 모든 좌위의 유전자형을 결정할 수 있게 하였다. 본 연구를 통하여 분석 된 춘란 40품종의 복합 유전자형은 모두 서로 다른 유전자 형을 보였으며, 아울러 국내·외에서 채집된 야생 춘란 150여 개체와도 동일한 유전자형은 발견되지 않았다.
- kr). 프로그램은 Excel 프로그램(Microsoft Co, USA)을 이용해 정해진 양식으로 각 좌위의 유전자형 데이터를 입력한 후, 제작된 프로그램으로 호환 불러오기하여 연결된 PF8t 바코드 전용프린터(Intermec Technol., Everett, WA, USA)로 출력하였다. 2차원 바코드는 작은 크기의 부착식 라벨지(25mm × 30mm)에 12mm × 12mm의 크기로 인쇄하여 사용할 수 있게 하였다.
대상 데이터
- SSR DNA ID 작성을 위한 춘란 검체는 관유정 난원(대구광역시 수성구 지산동 145)이 보유한 고정된 40품종으로부터 대략 1-5cm 길이의 잎을 절취하여 얻었다(www.nanacademy.co.kr). 춘란으로부터 절취한 조직은 액체질소를 이용하게 막자사발에서 분말로 파쇄한 후, 총 DNA는 Plant-easy genomic DNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 추출하였다.
- 춘란(C. goeringii)의 품종으로 확립된 서로 다른 40검체 (대구광역시 수성구 지산동 소재 관유정 난원에서 채취)로 부터 총 DNA를 분리한 후 SSR 유전자형을 결정하는데 사 용하였다. 각 품종의 등록 번호와 외관상 주요 특징은 Table 2 와 Fig.
이론/모형
- SSR 마커 8좌위를 동시 증폭하는 multiplex PCR을 수행하기 위해서 사용된 primer 서열은 Hyun et al.(2012)을 따랐으며, 각 좌위의 forward primer를 4종류의 형광 염색물질 중 한가지로 표지하였으며(FAM: CG459, CG722; VIC: CG1023, CG1210; NED: CG415, CG709; PET: CG787, CG1281), 동일한 형광으로 표지된 좌위들은 PCR 산물의 크기가 겹쳐지지 않게 primer 위치를 결정하였다. Multiplex PCR에 사용된 각 좌위별 반복단위의 염기서열, primer 서열 및 최종 농도, 그리고 유전자 은행(GenBank) 등록번호는 Table 1에 나타내었다.
- , 1997), 각 SSR 좌위에 대한 대립유전자 빈도는 Hyun et al.(2012)의 국내에서 채집된 야생 춘란의 결과를 따랐다. 고정된 고유 품종(개체) 별 복합 유전자형(combined genotype)으로부터 각 개체를 구분할 수 있는 식별능은 결합변별력(combined power of discrimination: CPD)으로 나타내었는데, CPD는 각 품종에 대한 각각의 SSR 좌위의 유전자형의 예상 출현빈도값을 곱하여 계산하였다(PowerStats V1.
- 수집된 품종에 대해 선별된 SSR 좌위가 개체식별 마커로서의 활용 가능성을 확인하기 위하여 각 좌위에 대한 유전자형을 multiplex PCR 방법으로 결정하였다(Table 3). 각 좌 위별 관찰된 대립유전자의 숫자는 각각 10개(CG415), 6개 (CG459), 10개(CG709), 13개(CG722), 9개(CG787), 11개 (CG1023), 12개(CG1210), 및 8개(CG1281)로 총 79개였으며, 평균은 좌위당 9.
- 춘란의 유전체로부터 분리된 8 SSR 좌위는 동시증폭 PCR(octaplex PCR) 방법으로 분석하였는데, Table 1에서 제시된 서로 다르게 차등화시킨 primer의 농도와 4종류의 형광표지를 적용하여 모든 좌위가 비슷한 수준으로 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 있었다(Fig. 2). 따라서 본 연구에서는 각각 다른 품종으로 고정된 C.
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