선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 고지방 식이에 의해 유도된 혈관염증에 홍삼 및 천마의 혼합투여가 홍삼 단독투여와 비교했을 때 혈관 염증 억제효과가 증폭되는지를 검증하기위해 진행되었다. 염증반응의 지속으로 인해 거품세포의 숫자가 증가하면서 일부가 괴사 하게 되고 죽은 세포들이 머금고 있던 지질이 배출되면서 죽상의 lipid core를 형성하게 된다.
- 오늘날, 고지혈증 치료제의 선택에 있어서 부작용이 중요하게 고려되고 있으며, 합성의약품보다는 이를 대체할 천연물과 한약재를 이용한 한방치료 기술 개발에 대한 관심이 증가되고 있다. 이에 본 연구에서는 전통생약의 효능을 과학적으로 검정하고 나아가 천연물로부터 고지혈증 치료제의 개발 가능성을 탐색하기 위해 홍삼과 천마 혼합추출물에 대하여 혈관 염증 억제효과를 검토하였다.
제안 방법
- 감별탈색을 위해 1% HCl-Alchol 에 5초씩 2번 침적시켜 수돗물로 세척하였다. 0.5% Ammonium Water로 중화 현색 한 뒤 수돗물에 세척하고, 세포질 염색을 1% eosin Y solution (Muto, Japan)에 2분 동안 침적 시킨 후 60%, 80%, 90%, 100% 알코올 순으로 탈수과정을 진행 하였다. xylene 용액에서 투명 과정을 거쳐 봉입제로 봉합 한 후 광학현미경으로 400배 시야에서 관찰한 후 사진을 촬영하였다(BX41, Olympus, Japan).
- 절편된 조직이 붙어 있는 슬라이드를 xylene 용액에 넣고 파라핀을 제거한다. 100%, 80%, 70% 알코올 순으로 탈 xylene, 함수 과정을 거쳤으며 수돗물에 세척하였다. 핵 염색을 위해 Harris hematoxylin solution(Sigma, USA)에 8분 동안 슬라이드를 침적시킨 후 수돗물에 세척하였다.
- 10주간 고지방식이를 실시하여 체중을 비교하였다. 고지방식이 투여군은 일반식이군에 비하여 현저히 체중이 증가하였으며, fluvastatin을 제외한 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군 모두에서 체중의 감소효과를 나타내었다(Table 1).
- 10주째 실험이 종료되는 날 동물은 단두로 희생되었고 C-rective protein(CRP)는 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(Biovendor CO., CZECH REPUBLIC)를 구입하여 ELISA reader (BIO-TEK Instruments, Inc., Winooski, Vermont, U.S.A.)에서 450 nm에서 측정하였다.
- 4)에 3일 고정시킨 후, 수세로써 조직 내에 남아 있는 포르말린을 제거하였다. 50% 알코올에서부터 100% 알코올까지 농도 상승 순으로 탈수하고 xylene으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 블록을 제작하였다.
- 1) Control(regular diet), 2) HFCD(high fat/choleserol diet), 3) fluvastatin(HFCD + 3 mg/kg/day of fluvastatin), 4) 홍삼 추출물(PG, HFCD + 200 mg/kg/day of PG), 5) 홍삼+천마 (1:1)(PGM, HFCD + 200 mg/kg/day of PGM). Control group은 10주 동안 regular diet를 시켰으며, HFCD group은 7.5% cocoa butter와 1.25% cholesterol(Research Diet. D12109)을 포함한 high fat/cholesterol diet를 시켰다. 그리고 fluvastatin, PG, PGM group은 4주 동안 HFCD를 먹이고, 이후 6주 동안은 HFCD와 함께 fluvastatin는 3 mg/kg/day, PG, PGM은 200 mg/kg/day를 각각 투여하였다.
- 전기 영동 후 gel 내 단백질들을 nitrocellulose membrane 에 전이시켰다. Membrane을 5%(w/v) non-fat dry milk가 포함된 Tris-buffered saline [TBS: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl] with 0.1% Tween-20(TBS-T)용액에 1시간 동안 담궈 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 blocking을 시행하였다. Blocking된 membrane에 1차 항체를 1 :1,000 비율로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다.
- 5% Ammonium Water로 중화 현색 한 뒤 수돗물에 세척하고, 세포질 염색을 1% eosin Y solution (Muto, Japan)에 2분 동안 침적 시킨 후 60%, 80%, 90%, 100% 알코올 순으로 탈수과정을 진행 하였다. xylene 용액에서 투명 과정을 거쳐 봉입제로 봉합 한 후 광학현미경으로 400배 시야에서 관찰한 후 사진을 촬영하였다(BX41, Olympus, Japan).
- 고지방 식이로 인한 혈관 염증 발현 여부를 확인하기 위하여 흉부대동맥 내 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 등의 adhesion molecule 단백질들의 발현을 확인하였다. Western blotting 결과, 정상식이 투여군에 비해 죽상경화 유발식이군에서 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 확연한 증가를 볼 수 있었 으며, fluvastatin 투여군과 홍삼 및 천마 혼합투여 군에서 유의적으로 감소하였다.
- 고지혈증 랫드모델에서 홍삼 및 천마 병용 투여에 의한 혈관병변 억제효과를 분석하기 위하여 흉부대동맥을 적출한 후, hematoxylin & eosin (H-E) staining을 실시하였다(Fig. 1).
- D12109)을 포함한 high fat/cholesterol diet를 시켰다. 그리고 fluvastatin, PG, PGM group은 4주 동안 HFCD를 먹이고, 이후 6주 동안은 HFCD와 함께 fluvastatin는 3 mg/kg/day, PG, PGM은 200 mg/kg/day를 각각 투여하였다.
- Blocking된 membrane에 1차 항체를 1 :1,000 비율로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 그후 TBS-T에 1 : 2,000 비율로 희석한 horseradish peroxide(HRP)-conjugated anti-mouse 혹은 goat IgG 항체와 상온에서 반응시키고, TBS-T로 충분히 세척한 다음, enhanced chemiluminescence system 을 이용하여 발현 측정 후 정량하였다.
- 고지방식이 투여군은 일반식이군에 비하여 현저히 체중이 증가하였으며, fluvastatin을 제외한 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군 모두에서 체중의 감소효과를 나타내었다(Table 1). 또한 쥐의 꼬리 동맥에서 수축기 평균혈압을 측정 하였다. 고지방식이 투여한 흰쥐의 수축기 평균혈압은 일반식이 투여한 군에 비해 변화를 보이지 않았으며, 3 mg/kg fluvastatin, 혹은 홍삼 단독투여 200 mg/kg, 홍삼 및 천마 혼합투여 200 mg/ml 을 각각 투여한 군에서 역시 유의성있는 변화를 보이지 않았다.
- 수축기 평균혈압은 automatic sphygmotonograph (Muromachi Kikai, Tokyo, Japan)를 이용하여 흰쥐의 꼬리 동맥에서 측정하였다. 각 개체마다 최소 8번 혈압을 측정하고 그 중 5 mmHg 내에 있는 5번의 측정값을 평균값으로 이용하였다.
- Plus mini kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사에서 제공된 방법에 따라 실시하였다. 추출된 total mRNA의 농도 및 순도를 UV 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 측정하였고, 0.05% diethyl pyrocarbonate (DEPC) 용액이 처리된 0.8% ethidium bromide로 염색한 agarose gel에서 28S와 18S rRNAs의 강도를 관찰함으로써 RNA의 상태를 확인하였다. Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) 을 이용한 유전자발현은 발표된 논문에 기술된 방식을 따랐다13).
- 50% 알코올에서부터 100% 알코올까지 농도 상승 순으로 탈수하고 xylene으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 블록을 제작하였다. 이렇게 준비된 파라핀 블록을 회전형 박절기(microtome; Thermo Electron Corporation, Pittsburg, PA)를 사용하여 6-7 ㎛으로 자른 뒤 슬라이드 위에 부착 시켜 실온에서 3일 동안 건조 시킨다.
- 홍삼 및 천마 혼합투여에 의한 혈관 염증 억제 효과를 알아보기 위하여 혈관염증을 반영해주는 표식인자로 간에서 합성되는 C-reactive protein (CRP) 농도를 분석하였다. 고지방식이 투여군에서의 CRP는 정상식이군보다 40% 이상 증가하는 것으로 나타났으며 fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 유의적으로 감소하였다.
- 홍삼과 천마는 모두 진안산으로 진안홍삼연구소에서 구입하였으며 각각 1 kg 씩 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하고, 삼각 플라스크에 홍삼과 천마를 각각 100 g 씩 증류수 3 L에 넣고 냉각기를 설치한 후 120분 간 가열하였다. 추출된 전탕액을 3,000 rpm으로 30분간 원심 분리 후 여 과지(Whatmann No.
- 흉부대동맥을 수집하여 Homogenase buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerolphosphate, 1 mM sodium vanadate, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]로 용해시켜 단백질을 추출하였다.
- 흰쥐는 온도 22±2℃, 습도 50 - 60%의 항온항습 장치에서 12시간씩 암기와 명기를 조절하면서 2 주간 적응기 후 다음과 같이 8 마리씩 5개 그룹으로 무작위로 구분하였다.
대상 데이터
- 실험은 동물실험 윤리위원회의 승인을 얻어 시행하였으며, 동물관리 규정을 준수하였다. 8 주령 수컷 SD계통의 흰쥐를 샘타코(오산, 한국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 흰쥐는 온도 22±2℃, 습도 50 - 60%의 항온항습 장치에서 12시간씩 암기와 명기를 조절하면서 2 주간 적응기 후 다음과 같이 8 마리씩 5개 그룹으로 무작위로 구분하였다.
데이터처리
- 수축기 평균혈압은 automatic sphygmotonograph (Muromachi Kikai, Tokyo, Japan)를 이용하여 흰쥐의 꼬리 동맥에서 측정하였다. 각 개체마다 최소 8번 혈압을 측정하고 그 중 5 mmHg 내에 있는 5번의 측정값을 평균값으로 이용하였다.
- 실험 결과의 유의성은 실험 결과를 Students t-test나 one-way ANOVA test를 통하여 p가 0.05이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.
이론/모형
- RNA의 분리는 RNeasyⓇ Plus mini kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사에서 제공된 방법에 따라 실시하였다. 추출된 total mRNA의 농도 및 순도를 UV 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 측정하였고, 0.
- 8% ethidium bromide로 염색한 agarose gel에서 28S와 18S rRNAs의 강도를 관찰함으로써 RNA의 상태를 확인하였다. Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) 을 이용한 유전자발현은 발표된 논문에 기술된 방식을 따랐다13). 실험에 사용된 primer는 다음과 같다.
- 5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerolphosphate, 1 mM sodium vanadate, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]로 용해시켜 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 Bradford(Bio-Bad, USA)법으로 정량하여 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)로 전기 영동하여 분리하였다. 전기 영동 후 gel 내 단백질들을 nitrocellulose membrane 에 전이시켰다.
성능/효과
- Monocyte chemoattractant protein(MCP-1)의 mRNA 발현은 고지방 식이 랫드의 흉부대동맥에서 일반식이 랫드에 비해 증가하는 것으로 나타났다. Fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 홍삼및 천마 혼합투여군 모두에서 유의성있게 감소하였다. 홍삼 단독투여군에 비하여 홍삼 및 천마 혼합투여군에서의 감소효과가 유의성을 보이는 것으로 나타났다(Fig.
- Monocyte chemoattractant protein(MCP-1)의 mRNA 발현은 고지방 식이 랫드의 흉부대동맥에서 일반식이 랫드에 비해 증가하는 것으로 나타났다. Fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 홍삼및 천마 혼합투여군 모두에서 유의성있게 감소하였다.
- 고지방 식이를 투여한 흰쥐에서 6주간 홍삼 단독투여 또는 홍삼 및 천마를 혼합투여했을 때 체중감소효과를 나타내었으며, 혈관내막의 비후도를 안정시키는 항-죽상경화 효과를 확인하였다. 특히 홍삼 및 천마 혼합투여는 세포유착분자나 CRP와 같은 염증분자들을 감소시킴으로써 홍삼 단독투여와 달리 혈관 내막의 안정화를 증폭시키고 혈관염증을 개선시키는 것으로 사료된다.
- 홍삼 및 천마 혼합투여에 의한 혈관 염증 억제 효과를 알아보기 위하여 혈관염증을 반영해주는 표식인자로 간에서 합성되는 C-reactive protein (CRP) 농도를 분석하였다. 고지방식이 투여군에서의 CRP는 정상식이군보다 40% 이상 증가하는 것으로 나타났으며 fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 유의적으로 감소하였다. 홍삼 단독투여군과 홍삼 및 천마 혼합투여군을 비교했을 때 CRP의 감소효과에 대한 유의성이 나타났다(Fig.
- 10주간 고지방식이를 실시하여 체중을 비교하였다. 고지방식이 투여군은 일반식이군에 비하여 현저히 체중이 증가하였으며, fluvastatin을 제외한 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군 모두에서 체중의 감소효과를 나타내었다(Table 1). 또한 쥐의 꼬리 동맥에서 수축기 평균혈압을 측정 하였다.
- 또한 쥐의 꼬리 동맥에서 수축기 평균혈압을 측정 하였다. 고지방식이 투여한 흰쥐의 수축기 평균혈압은 일반식이 투여한 군에 비해 변화를 보이지 않았으며, 3 mg/kg fluvastatin, 혹은 홍삼 단독투여 200 mg/kg, 홍삼 및 천마 혼합투여 200 mg/ml 을 각각 투여한 군에서 역시 유의성있는 변화를 보이지 않았다. 신기능을 측정하는 검사에서 BUN (blood urea nitrogen) 및 혈청 가장 대표적이다.
- 본 실험에서의 신기능을 측정하는 검사에서 BUN 및 혈청 creatinine 수치는 고지 방식이 투여한 군과 일반식이 투여한 군 모두 정상범위에 속하였다. 그러나 양성대조군인 fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군에서 혈청 creatinine 수치가 유의성있게 증가하였으며 홍삼 및 천마 혼합 투여군에서는 정상범위에 속하는 것으로 나타났다.
- 여기에서 홍삼 및 천마 혼합투여군은 세포유착분자의 발현 결과와 마찬가지로 홍삼 단독투여군에 비하여 그 감소효과가 현저히 증가하였다. 그러므로 이러한 결과는 홍삼 및 천마 혼합투여가 고지방식이로 인한 죽상경화의 초기 단계에 작용하여 세포유착 분자 및 chemokine 의 발현을 억제하여 혈관보호효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 더 나아가 고지방식이로 인한 혈관염증 과정에서 홍삼 단독투여보다는 홍삼과 천마를 혼합투여 시 혈관염증 억제가 더욱 증폭되어 효과적이라는 것을 의미한다.
- 4). 그러므로 홍삼 및 천마 혼합투여군이 홍삼 단독투여군보다 CRP의 감소효과가 더 큰 것으로 나타났다.
- 한편 양성대 조군인 fluvastatin 군과 홍삼 단독투여군, 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 혈관 내막과 중막의 병변은 없는 것으로 나타났다. 내막과 중막의 비후 도는 고지혈증 랫드모델에서 일반식이에 비하여 유의적으로 증가하였으며, fluvastatin, 홍삼 단독 투여군, 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 유의 적으로 감소하였다. 여기에서 홍삼 및 천마 혼합 투여군은 홍삼 단독투여군과 비교했을 때 유의적으로 비후도를 감소시켰다.
- 그러므로 이러한 결과는 홍삼 및 천마 혼합투여가 고지방식이로 인한 죽상경화의 초기 단계에 작용하여 세포유착 분자 및 chemokine 의 발현을 억제하여 혈관보호효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 더 나아가 고지방식이로 인한 혈관염증 과정에서 홍삼 단독투여보다는 홍삼과 천마를 혼합투여 시 혈관염증 억제가 더욱 증폭되어 효과적이라는 것을 의미한다.
- 실험결과에서 10주간의 고지방 식이 투여는 현저한 체중증가를 유도하였으며 fluvastatin, 홍삼 단독투여, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 감소하였다. 또한 홍삼 단독투여군과 홍삼 및 천마 혼합투여군 모두 고지방 식이 투여에 의한 흉부대동맥 내피층 표면의 거칠고, 중막 평활근의 비후함을 개선시켰다. 홍미롭게도 홍삼및 천마 혼합투여군은 홍삼 단독투여군에 비하여 혈관 내막의 안정화를 유의적으로 증폭시켰다.
- 또한 세포 유착분자인 ICAM-1, VCAM-1, P-selectin의 선택적인 결실은 죽상경화의 유발을 현저히 감소시켰다27). 본 실험결과에서 고지방식이군은 흉부 대동맥내 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현을 현저히 증가시켰다. 흥미롭게도 홍삼 단독투여군은 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현을 억제시키지 못하였다.
- 최근에는 CRP와 동맥경화 인자인 대동맥의 stiffness간에 연관이 있으며, CRP와 복대동맥 및 신동맥가지의 동맥경화 간의 연관관계를 보고하였다30,31). 본 연구에서는 고지방식이 투여군에서 혈청 CRP 수준이 현저하게 증가하였고, fluvastatin 및 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 혈청 CRP 수준은 유의적으로 감소하였다. 여기에서 홍삼 단독투여군보다 홍삼 및 천마 혼합투여군의 감소폭이 유의성있게 감소효과가 증폭되는 것으로 나타났다.
- 최근 연구에 따르면 고지방 식이는 흰쥐에서 인슐린 저항성과 체중 증가를 유도하고 이로 인해 혈관 내피세포가 손상된다고 보고했다18). 실험결과에서 10주간의 고지방 식이 투여는 현저한 체중증가를 유도하였으며 fluvastatin, 홍삼 단독투여, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 감소하였다. 또한 홍삼 단독투여군과 홍삼 및 천마 혼합투여군 모두 고지방 식이 투여에 의한 흉부대동맥 내피층 표면의 거칠고, 중막 평활근의 비후함을 개선시켰다.
- 본 연구에서는 고지방식이 투여군에서 혈청 CRP 수준이 현저하게 증가하였고, fluvastatin 및 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 혈청 CRP 수준은 유의적으로 감소하였다. 여기에서 홍삼 단독투여군보다 홍삼 및 천마 혼합투여군의 감소폭이 유의성있게 감소효과가 증폭되는 것으로 나타났다. 또한 신기능 지표에서 fluvastatin과 홍삼 단독투여군의 혈청 creatinine 증가 양상은 합성의약품과 홍삼의 장기적인 투여가 신기능 장애를 유발할 것이라는 견해를 보인다.
- 그러나 홍삼 및 천마 혼합투여군은 고지방 식이에 의해 증가한 세포유착 분자인 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현을 현저하게 감소시켰다. 염증의 증폭과 유지에 홍삼 단독투여 또는 홍삼 및 천마 혼합투여의 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR를 수행한 결과, 고지방 식이군에서 현저히 증가된 MCP-1 mRNA의 발현은 fluvastatin, 홍삼 단독투여, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 감소하였다. 여기에서 홍삼 및 천마 혼합투여군은 세포유착분자의 발현 결과와 마찬가지로 홍삼 단독투여군에 비하여 그 감소효과가 현저히 증가하였다.
- 1). 정상식이의 랫드 군에서는 혈관병변이 나타나지 않았으나, 고지방식이 투여한 군의 흉부대동맥의 내피층 표면은 일반식이 투여한 군에 비해 거칠고, 중막 평활근은 비후해짐을 확인할 수 있었다. 한편 양성대 조군인 fluvastatin 군과 홍삼 단독투여군, 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 혈관 내막과 중막의 병변은 없는 것으로 나타났다.
- 정상식이의 랫드 군에서는 혈관병변이 나타나지 않았으나, 고지방식이 투여한 군의 흉부대동맥의 내피층 표면은 일반식이 투여한 군에 비해 거칠고, 중막 평활근은 비후해짐을 확인할 수 있었다. 한편 양성대 조군인 fluvastatin 군과 홍삼 단독투여군, 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 혈관 내막과 중막의 병변은 없는 것으로 나타났다. 내막과 중막의 비후 도는 고지혈증 랫드모델에서 일반식이에 비하여 유의적으로 증가하였으며, fluvastatin, 홍삼 단독 투여군, 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 유의 적으로 감소하였다.
- 고지방식이 투여군에서의 CRP는 정상식이군보다 40% 이상 증가하는 것으로 나타났으며 fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 그리고 홍삼 및 천마 혼합투여군에서 모두 유의적으로 감소하였다. 홍삼 단독투여군과 홍삼 및 천마 혼합투여군을 비교했을 때 CRP의 감소효과에 대한 유의성이 나타났다(Fig. 4). 그러므로 홍삼 및 천마 혼합투여군이 홍삼 단독투여군보다 CRP의 감소효과가 더 큰 것으로 나타났다.
- Fluvastatin 투여군과 홍삼 단독투여군, 홍삼및 천마 혼합투여군 모두에서 유의성있게 감소하였다. 홍삼 단독투여군에 비하여 홍삼 및 천마 혼합투여군에서의 감소효과가 유의성을 보이는 것으로 나타났다(Fig. 3).
후속연구
- 이러한 결과는 홍삼과 천마의 혼합투여가 혈중의 염증 인자들을 감소시켜 동맥경화나 고혈압과 같은 심혈관계 질환에 좋은 효과가 있음을 제시한다. 본 연구에서 홍삼 및 천마 혼합투여군에 의한 혈관염증 개선효과가 홍삼 단독투여군보다 유의성있는 개선효과를 보여주었으므로 이러한 유의적 효과가 홍삼과 천마 혼합투여에 의한 것인지 천마 자체에 의한 혈관염증 개선효과에 기인한 것인지는 추후의 연구가 필요하다고 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.