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문제 정의
- 국내에서 식품 중 fluoroquinolone계 항균제 분석은 축산물을 대상으로 한 것이 대부분이고, 어류나 갑각류 등의 수산물에 대한 연구(7-12)는 미흡하여 자료가 부족한 상황이다. 따라서 본 연구는 HPLC-FLD와 LC-MS를 이용하여 fluoroqinolone계 항균제의 잔류량을 분석하고, 수산물의 잔류 fluoroqinolone계 모니터링을 통하여 항생제에 대한 수산물의 안전성 평가의 기초자료로 이용하고자 하였다.
- 2011년 1월부터 12월까지 서울 가락시장, 노량진시장, 강서시장 등의 도매시장과 대형마트에서 유통되고 있는 어류(254건), 갑각류(14건) 등 총 268건을 대상으로 본 실험에 사용하였다. 시중에 유통되고 있는 수산물 중의 fluoroquinolone계의 잔류량을 파악하고, 안전성을 검토하기 위하여 현재 잔류 기준이 설정되어 있는 어류와 갑각류 두 품목에 대하여 실험을 실시하였다. 구입한 시료는 바로 껍질과 내장을 제거한 후 가식부인 근육부위를 채취하여 mixer로 균질화시켜 사용하였다.
제안 방법
- 2 mg/L 수준의 농도가 되도록 20% acetonitrile로 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 이를 HPLCFLD와 LC-MS로 각각 분석하여 검량선을 작성하였다.
- 예비실험을 통하여 fluoroquinolone계 물질이 검출되지 않은 시료(넙치, 가물치, 미꾸라지 및 새우 각 1종)에 표준물질의 농도가 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 mg/L 수준이 되도록 표준용액을 첨가하고 위의 시험용액을 조제하는 방법과 동일하게 전처리하여 회수율을 측정하였다.
- 시료 중의 fluoroquinolone계 항균제를 분석하기 위하여 기기는 HPLC와 LC-MS를 사용하였다. HPLC는 1100 Series(Agilent, Santa Clara, CA, USA)로, 검출기는 fluorescence detector(FLD, G1321A, Agilent), 컬럼은 Shiseido capcell pak C18(Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였다.
- LC-MS는 LC 부분이 Acquity UPLC® system(Waters, Milford, MA, USA)으로 컬럼은 Acquity UPLC® HSS T3을 사용하였고 MS 부분은 Acquity® SQD (C09SQD452W, Waters)를 사용하였다. 이온화 모드는 ESI(electrospray ionization), positive 모드를 선택하였고 ofloxacin 362.1, norfloxacin 320.3, pefloxacin 334.0, ciprofloxacin 332.0, enrofloxacin 360.0을 parent 이온으로 하여 각각 40, 35, 38, 38, 39의 cone voltage 조건으로 MS 분석을 수행하였다. 시료분석을 위한 HPLC-FLD와 LC-MS의 기기조건은 Table 1-3과 같았다.
- 5종의 fluoroquinolone계 항균제의 표준혼합용액을 단계 희석(0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 mg/L 수준)하여 형광검출기로 여기파장 278 nm, 측정파장 455 nm에서 분석하여 검량선을 작성한 결과는 Fig. 1과 같다. Fluoroquinolone계 5종 모두 상관계수가 0.
- 어류 및 갑각류 총 268건에 대하여 HPLC-FLD를 이용하여 fluoroquinolone계 항균제를 분석하였고, 그 결과 검출된 시료는 LC-MS로 확인시험을 하였다. Fluoroquinolone계 항균제의 잔류량을 조사한 결과 총 20건이 검출되어 7.
- 어류 및 갑각류 중에 잔류하는 fluoroquinolone계 항균제를 조사하기 위하여 HPLC-FLD와 LC-MS를 이용하여 분석을 실시하였다. HPLC-FLD를 이용하여 분석하였을 때 검출한계와 정량한계는 각각 0.
대상 데이터
- 2011년 1월부터 12월까지 서울 가락시장, 노량진시장, 강서시장 등의 도매시장과 대형마트에서 유통되고 있는 어류(254건), 갑각류(14건) 등 총 268건을 대상으로 본 실험에 사용하였다. 시중에 유통되고 있는 수산물 중의 fluoroquinolone계의 잔류량을 파악하고, 안전성을 검토하기 위하여 현재 잔류 기준이 설정되어 있는 어류와 갑각류 두 품목에 대하여 실험을 실시하였다.
- 시중에 유통되고 있는 수산물 중의 fluoroquinolone계의 잔류량을 파악하고, 안전성을 검토하기 위하여 현재 잔류 기준이 설정되어 있는 어류와 갑각류 두 품목에 대하여 실험을 실시하였다. 구입한 시료는 바로 껍질과 내장을 제거한 후 가식부인 근육부위를 채취하여 mixer로 균질화시켜 사용하였다.
- Fluoroquinolone계의 분석을 위한 표준물질로, enrofloxacin은 Mp Bi℃hemicals사(Solon, OH, USA), ciprofloxacin은 Fluka사(Buchs, Switzerland), ofloxacin과 norfloxacin은 Sigma사(St. Louis, MO, USA), pefloxacin은 Dr. Ehrenstorfer GmbH사(Augsbuirg, Germany) 제품을 사용하였다. 시료 전처리 및 분석용 시약으로 사용한 trichloroacetic acid, triethylamine, tetrahydrofuran는 모두 Sigma사(USA) 제품을 사용하였으며, acetonitrile과 methanol은 Fisher Scientific사(Loughborough, UK), n-hexane은 J.
- Ehrenstorfer GmbH사(Augsbuirg, Germany) 제품을 사용하였다. 시료 전처리 및 분석용 시약으로 사용한 trichloroacetic acid, triethylamine, tetrahydrofuran는 모두 Sigma사(USA) 제품을 사용하였으며, acetonitrile과 methanol은 Fisher Scientific사(Loughborough, UK), n-hexane은 J.T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA), formic acid는 Fluka사(Buchs, Switzerland), 여과용 필터는 Advantec사(5A, Tokyo, Japan), 0.2 nylon syringe filter는 Whatman사(Brentford, UK) 제품을 사용하였다.
- LC-MS는 LC 부분이 Acquity UPLC® system(Waters, Milford, MA, USA)으로 컬럼은 Acquity UPLC® HSS T3을 사용하였고 MS 부분은 Acquity® SQD (C09SQD452W, Waters)를 사용하였다.
데이터처리
- HPLC-FLD와 LC-MS로 측정한 fluoroquinolone계 5종의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 Table 4와 같이 나타났다. 검출한계는 3.3(s/S), 정량한계는 10(s/S) 계산식을 이용하여 측정하였고, s는 회귀선(regression line)에서 절편의 표준편차이며 S는 검량선 기울기의 평균값을 이용하였다. HPLC-FLD의 경우 검출한계와 정량한계는 각각 0.
이론/모형
- 시료는 식품공전(13)의 시험방법에 준하여 전처리하였다. 균질화한 검체를 약 5 g 취한 후 50% acetonitrile을 40 mL 가하여 2분간 균질화한 다음 80℃ water bath(Vision scientific, Bucheon, Korea)에서 10분간 열처리한 후 방냉하였다.
- HPLC는 1100 Series(Agilent, Santa Clara, CA, USA)로, 검출기는 fluorescence detector(FLD, G1321A, Agilent), 컬럼은 Shiseido capcell pak C18(Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였다. HPLC-FLD로 fluoroquinolone계 물질이 검출된 시료는 LC-MS를 이용한 확인시험법으로 표준물질과의 일치를 확인하였다. LC-MS는 LC 부분이 Acquity UPLC® system(Waters, Milford, MA, USA)으로 컬럼은 Acquity UPLC® HSS T3을 사용하였고 MS 부분은 Acquity® SQD (C09SQD452W, Waters)를 사용하였다.
성능/효과
- 측정된 HPLC-FLD의 검출한계와 정량한계 수준은 Choi 등(7) 및 Kim 등(12)의 연구결과와 비슷하거나 약간 높은 것으로 나타났다. 이는 기기 종류 및 상태에 따라 편차가 있을 수 있는 것이며, 검출한계와 정량한계 모두 LC-MS가 HPLC-FLD보다 낮게 측정되어 LC-MS로 분석하는 것이 HPLC 보다 더 정밀한 수준까지 정량할 수 있을 것으로 보여진다. 또 Roger의 연구(14)에 의하면 변이계수(CV, %)값이 15% 이하일 때 분석값에 대한 재현성이 양호하다고 보고하고 있으므로 본 연구에서 fluoroquinolone 5종에 대한 HPLC-FLD와 LC-MS의 LOD, LOQ의 재현성은 양호한 것으로 판단된다.
- 어류 및 갑각류 총 268건에 대하여 HPLC-FLD를 이용하여 fluoroquinolone계 항균제를 분석하였고, 그 결과 검출된 시료는 LC-MS로 확인시험을 하였다. Fluoroquinolone계 항균제의 잔류량을 조사한 결과 총 20건이 검출되어 7.5%의 검출율을 나타내었다(Table 6). Ofloxacin, norfloxacin과 pefloxacin은 모든 시료에서 검출되지 않았고 ciprofloxacin과 enrofloxacin은 각각 3.
- 어류 및 갑각류 중에 잔류하는 fluoroquinolone계 항균제를 조사하기 위하여 HPLC-FLD와 LC-MS를 이용하여 분석을 실시하였다. HPLC-FLD를 이용하여 분석하였을 때 검출한계와 정량한계는 각각 0.0030-0.0083, 0.0090-0.0252 mg/kg이었고, LC-MS는 각각 0.0019-0.0040, 0.0059-0.0122 mg/kg으로 나타났다. ofloxacin, norfloxacin, pefloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin의 회수율은 76.
- 7%의 검출율을 보였다. 시료 268건 중 동자개, 장어, 미꾸라지, 붕어, 가물치 등 5종의 어류에서 ciprofloxacin 및 enrofloxacin이 검출되었으며 enrofloxacin의 검출율이 6.7%로 가장 높게 나타났다. 어종별 검출율은 장어가 2.
- 7%로 가장 높게 나타났다. 어종별 검출율은 장어가 2.6%(7건)로 가장 높았고 미꾸라지 2.2%(6건), 동자개 1.5%(4건), 붕어 0.7%(2건), 가물치 0.4%(1건) 순서로 나타났다. 장어는 모든 시료 중에서 ciprofloxacin과 enrofloxacin의 검출율이 가장 높았다(Table 6).
- 4%(1건) 순서로 나타났다. 장어는 모든 시료 중에서 ciprofloxacin과 enrofloxacin의 검출율이 가장 높았다(Table 6). HPLC-FLD와 LC-MS를 이용하여 분석한 fluoroquinolone계 5종의 표준품과 검출된 시료의 크로마토그램은 Fig.
- Fluoroquinolone계 항균제가 검출된 시료에서 ciprofloxacin과 enrofloxacin의 합으로써 검출 농도를 나타낸 결과는 Table 7과 같다. 검출농도는 동자개 0.0267-1.07 mg/kg, 미꾸라지 0.0079-0.0849 mg/kg, 장어 0.0108-0.0925 mg/kg, 붕어 0.0217-0.0302 mg/kg, 가물치 0.0212 mg/kg으로 나타났으며 검출된 20건 중에서 19건은 현행 우리나라 식품공전상에서 어류의 잔류허용기준치인 0.1mg/kg 보다 낮은 결과를 나타내었고 동자개 1건만이 기준치보다 높은 1.07 mg/kg의 농도로 나타났다. 그러므로 수산물에 대한 fluoroquinolone계 항균제의 잔류실태는 비교적 안전한 수준이라고 판단되나, 잔류허용기준치보다 높게 검출되는 시료가 있는 것으로 보아 아직도 수산물의 동물용의약품 사용에 대한 구체적인 지식 없이 이를 무분별하게 오남용하는 양식업 종사자들이 있는 실정이다.
- 5%의 검출율을 나타내었다(Table 6). Ofloxacin, norfloxacin과 pefloxacin은 모든 시료에서 검출되지 않았고 ciprofloxacin과 enrofloxacin은 각각 3.4%와 6.7%의 검출율을 보였다. 시료 268건 중 동자개, 장어, 미꾸라지, 붕어, 가물치 등 5종의 어류에서 ciprofloxacin 및 enrofloxacin이 검출되었으며 enrofloxacin의 검출율이 6.
- 0122 mg/kg으로 나타났다. ofloxacin, norfloxacin, pefloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin의 회수율은 76.4-104.6% 범위로 분석되었다. 총 268건에 대하여 fluoroquinolone계 항균제의 잔류량을 조사한 결과 7.
- 6% 범위로 분석되었다. 총 268건에 대하여 fluoroquinolone계 항균제의 잔류량을 조사한 결과 7.5%의 검출율을 나타내었고, 동자개 1건에서 enrofloxacin과 ciprofloxacin의 합이 허용 기준치인 0.1 mg/kg보다 높게 검출되었다. Ofloxacin, norfloxacin과 pefloxacin은 모든 시료에서 검출되지 않았고 ciprofloxacin과 enrofloxacin은 각각 3.
- 7%의 검출율을 보였다. 어종별 검출율은 장어(2.6%), 미꾸라지(2.2%), 동자개(1.5%), 붕어(0.7%), 가물치(0.4%) 순서로 나타났다.
- 2 mg/L 수준(ofloxacin은 감도가 낮으므로 약 2배 높은 농도로 측정)이 되도록 표준용액을 첨가하여 HPLCFLD로 회수율을 측정한 결과는 Table 5와 같다. 넙치, 가물치, 미꾸라지와 새우 4종류에 대한 회수율은 ofloxacin의 경우 80.6-102.6%, norfloxacin 80.1-103.0%, pefloxacin 76.4-104.2%, ciprofloxacin 78.0-104.6%, enrofloxacin 83.6-100.6%로 나타났다. 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC)에서의 회수율 권장범위가 70-110%(분석물질의 농도 10-100 mg/L인 경우)인 점을 고려할 때 본 연구에서 5종의 fluoroquinolone계 회수율이 대부분 80% 이상이므로 양호한 결과인 것으로 판단된다.
후속연구
- 정부에서는 이들이 동물용의약품에 대한 휴약 기간을 준수하고 오남용하는 것을 방지하기 위하여 지속적으로 교육 및 홍보를 실시하고, 동물용의약품 모니터링 등을 통하여 꾸준히 관리하는 것이 필요할 것으로 보인다. 현재 수산물에 대한 항생제 및 항균제 등의 동물용의약품에 관한 연구가 미흡한 상황이므로 지속적인 모니터링을 통하여 수산물의 안전성 검토를 위한 연구가 수행되어야 할 것이다.
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