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문제 정의
- 1) 그러나 항산화 활성으로는 gallic acid aldehyde가 항산화활성을 나타낸다는 보고가 있으나 그 이상의 연구는 보고되지 않았다.1) 따라서 항산화 활성에 관한 체계적인 연구를 수행하고자 우선 뱀무의 화학적 성분연구에 착수하여 새로운 연구결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 10분간에 걸처 25 μM 농도의 DCFDA 용액을 가하여 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 측정하였다.
- 7729) column chromatography를 실시하여 화합물 1 (114 mg)을 얻었다. EtOAc 분획 (116.8 g)을 silica gel (no. 7734) column에 걸어 CH2Cl2 /MeOH 용매로 gradient elution시켜 chromatography를 실시하여 7개의 소분획 (Fr. E-01~Fr. E-07)으로 나누고 이중 소분획 E-03 (10 g)에 대하여 hexane/EtOAc (gradient)의 용출용매로 재차 silica gel (no. 7729) column chromatography를 실시하여 12개의 소분획들(E-03-01~E-03-12)을 얻었다. 소분획 E-03-05 (26 mg)를 다시 silica gel (no.
- Hexane 분획 (39.5 g)을 silica gel (no. 7734) column에 걸어 chromatography를 실시하였다. 용출용매로 hexane 및 hexane/CH2Cl2 (1 : 1)로 용출시켜 4개의 소분획 (Fr.
- 뱀무의 MeOH 엑스를 얻고 이를 분획하여 hexane, EtOAc 및 BuOH 분획들을 얻었다. Hexane 분획에 대하여 column chromatography를 실시하여 잘 알려진 monoterpene계 화합물인 eugenol (1)을 분리하였다. EtOAc 분획에 대하여서도 column chromatography를 반복 실시하여 ursane계와 19α- hydroxyursane계의 대표적인 화합물들로 장미과 식물에 널리 분포하고 있는 화합물들인 ursolic acid 3-acetate (2)와 ursonic acid (6), ursolic acid (7), pomolic acid 3-acetate (5), pomolic acid (8) corosolic acid (9), euscaphic acid (11), tormentic acid (18) 및 23-hydroxytormentic acid (21) 등을 분리 하였다.
- 등은 분광학적 데이터에 의해 쉽게 확인할 수 있었으며, 표준품들과 직접적으로 대조하여 확정하였다. Pomolic acid 3-acetate (5)는 CD3OD 및 CDCl3 용액 중에서 각각 2D-NMR (Fig. 2)에 의하여 assignment를 하였다. 문헌에 따르면 Fraga 등11)은 이 화합물의 NMR 데이터를 최근 발표하였으나, 이중 C-23 및 C-29의 chemical shift값은 서로 바꿔어 assignment 되어 있으므로 수정되어야 함을 확인하였다.
- spinosa (Rhamnaceae)25) 등에서 분리 보고된 바 있다. 또한 cecropiacic acid 3-methyl ester는 최근에 같은 장미과 식물인 Potentilla multicaulis로부터 분리된 바 있으며,26) 이번에 두 번째로 분리된 물질임을 확인하였으며, CD3OD 용액 중에서 측정한 NMR 데이터를 처음으로 제시하였다.
- 뱀무의 MeOH 엑스를 얻고 이를 분획하여 hexane, EtOAc 및 BuOH 분획들을 얻었다. Hexane 분획에 대하여 column chromatography를 실시하여 잘 알려진 monoterpene계 화합물인 eugenol (1)을 분리하였다.
- 세포내 ROS 소거력 측정 및 세포생존력 시험 − 세포내 ROS 소거력 시험은 HaCaT 세포 (0.5 × 105 cell/ml)를 사용 하여 기 확립된 DCF-DA법을 약간 변형시켜 사용하였다.
- 세포생존력 측정은 HaCaT 세포 (0.5 × 105 cell/ml)를 96- well에 이식 후 16시간 후에 사용하여 화합물 17, 19 및 25 각 50 μM을 가한 후 37o에서 24시간 배양하였다.
- 소분획 E-03-05-08 (7 mg)도 같은 방법으로 RP-18 column 에 걸어 60% MeOH로 용출시켜 얻은 분획을 농축하여 화합물 3 (5 mg)을 분리하였다. 소분획 E-03-09 (79 mg)를 hexane/EtOAc (gradient)의 용출용매로 silica gel (no. 7729) column chromatography를 실시하여 화합물 4 (2 mg), 5 (10 mg) 및 6 (10 mg)을 얻었다. 소분획 E-03-11 (1.
- 7734) column에 걸어 chromatography를 실시하였다. 용출용매로 hexane 및 hexane/CH2Cl2 (1 : 1)로 용출시켜 4개의 소분획 (Fr. H-01~Fr. H-04)을 얻고 이중 소분획 H-02 (3.1 g)에 대하여 hexane/EtOAc (gradient)의 용출용매로 재차 silica gel (no. 7729) column chromatography를 실시하였다. 이로부터 얻어진 소분획 H-02-04 (2 g)에 대하여 CH2Cl2 및 CH2Cl2 / MeOH (100 : 0.
- 5 g)을 얻었다. 이어서 수층에 EtOAc를 가하여 진탕 방치하여 얻어진 EtOAc 분획을 농축하여 EtOAc 분획 (116.8 g)을 얻고, 수층에 동량의 BuOH를 가하여 진탕 방치하여 BuOH 분획 (92.8 g)을 얻었다.
- 추출 및 분획 −뱀무 전초 4.6 kg을 세절하여 MeOH로 실온에서 냉침 (10 L × 8) 추출하여 MeOH 추출물을 얻고, 이를 H2O로 현탁시켜 동량의 hexane을 가하여 진탕 방치하여 얻어진 hexane 분획을 농축하여 hexane 분획 (39.5 g)을 얻었다.
대상 데이터
- , USA)의 LS-5B spectrofluorometer를 사용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 측정하였다. Column chromatography용 silica gel은 Merck (Merck KGaA, Germany)의 Kieselgel 60 (no. 7734, 9385 또는 7729)을, 역상크로마토그라피는 Merck의 LiChroprep RP-18을 사용하였다. Gel 여과는 Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences AB, Sweden)을 사용하였다.
- 7734, 9385 또는 7729)을, 역상크로마토그라피는 Merck의 LiChroprep RP-18을 사용하였다. Gel 여과는 Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences AB, Sweden)을 사용하였다. TLC plate는 Merck의 Kieselgel 60F254, RP-18254S precoated plate 또는 Merck의 precoated cellulose plate를 사용하였다.
- N-Acetylcysteine (NAC)과 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- UV는 Hitachi U-3010 (Hitachi High-Technologies Corporation, Japan)을 사용하였으며, IR은 Jasco FT/IR-5300을 사용하여 측정하였다. NMR은 Varian (Varian Associates Inc., USA) 의 Gemini 2000 (300MHz), Bruker (Bruker BioSpin Corp., USA)의 Avance-400 (400MHz) 또는 Avance-500 (500MHz) spectrometer를 사용하여 측정하였으며, EI-MS는 Hewlett- Packard (Hewlett-Packard Company, USA)의 5989B GC/ MS, FAB-MS는 Jeol (JEOL Ltd., Japan)의 JMS-700 high resolution mass spectrometer를 사용하였다. 형광도 측정은 Perkin Elmer (PerkinElmer Inc.
- Gel 여과는 Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences AB, Sweden)을 사용하였다. TLC plate는 Merck의 Kieselgel 60F254, RP-18254S precoated plate 또는 Merck의 precoated cellulose plate를 사용하였다. N-Acetylcysteine (NAC)과 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)는 Sigma (St.
- 기기 및 시약 −선광도는 Jasco P-1020 polarimeter (JASCO Corporation, Japan)를 사용하여 측정하였다. UV는 Hitachi U-3010 (Hitachi High-Technologies Corporation, Japan)을 사용하였으며, IR은 Jasco FT/IR-5300을 사용하여 측정하였다. NMR은 Varian (Varian Associates Inc.
- 세포배양 − HaCaT (human keratinocyte) 세포는 열처리로 불활성화 시킨 10% 송아지 태반혈청(GibcoBRL, MD, USA), streptomycin (100 μg/ml) 및 penicillin (100 U/ml)이 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지를 사용하여 5% CO2, 37o로 유지시킨 배양기에서 배양하였다.
- 실험재료 −본 실험에 사용한 시료는 충남대학교 약학대학 약초원에서 재배하고 있는 시료를 2009년 6월 하순에 채취하여 풍건한 것으로 충남대학교 배기환교수가 감정하여 제공하였다.
이론/모형
- Protective effects of isoquercitrin (17), gallic aldehyde (19), and ducheside B (25) on H2O2-induced cell death. The cell viability was determined by MTT assay. Each bar represents the mean ± the standard error from tetraplicate experiments.
성능/효과
- 0) 등에서 강하게 나타나고 있는 것으로도 이를 증명할 수 있었다.19) A환의 구조는 2D-NMR을 해석하여 확정할 수 있었다. 즉 Fig.
- 19) 각 oxygenated methine proton들은 이들의 3J 값으로 보아 2α-OH (H-2ax), 3β-OH (H-3ax), 19α-OH (H-19eq)로 결합하고 있는 것으로 결정할 수 있었으며, 이들 결과를 종합하면이 화합물 16의 화학구조는 2α,3β,19α-trihydroxyolean-12- en-28-oic acid 즉 arjunic acid 임을 확인하였다.
- 3,4) 이들 화합물들은 각 50 μM 농도에서 인간의 HaCaT keratinocyte에 대하여 생존율이 각각 94%, 92.4% 및 93.6%로 세포독성을 나타내지 않았다.
- 28-30) 이 화합물도 Geum속 식물로부터 처음으로 분리 확인된 물질임을 확인하였다. EtOAc 분획 중 극성이 강한 소분획들로부터 분리한 2개의 saponin들은 장미과 식물에서 널리 분포하고 있는 rosamultin (22) 및 kaji-ichigoside F1 (23) 임을 확인하였다.6,13,31) Rosamultin (22)은 이미 이 식물로부터 분리된 바 있으나,17) kaji-ichigoside F1 (23)은 Geum속 식물로부터 처음 분리된 화합물이다.
- 분리한 화합물 중 (+)-dehydrovomifoliol, 3,3'- di-O-methylellagic acid 및 apigenin을 제외한 22종에 대하여 항산화활성을 검색하기 위하여 세포내 활성산소 (ROS) 소거력을 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) 법으로 검색한 결과 isoquercitrin만이 강한 항산화 활성을 나타내었고, 다른 화합물들은 활성이 없거나 약하게 나타냄을 확인하였다.
- 분리한 화합물 중 3,3'-di-O-methylellagic acid (12), apigenin (13) 및 (+)-dehydrovomifoliol (15)의 3종을 제외한 22종에 대하여 항산화활성을 검색하기 위하여 세포내 활성산소 (ROS) 소거력을 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)법으로 검색한 결과 Table II에 나타낸 바와 같이 2 μM 농도에서 83.5% 소거력을 나타낸 Nacetylcysteine (NAC)에 비하여 50 μM 농도에서 isoquercitrin (17)만이 강한 항산화 활성 (75.2%)을 나타내었고, gallic aldehyde (19)와 ducheside B (25)는 각각 46.9%와 47.6%로 약한 활성을 나타내었으며, 다른 화합물들은 활성이 없거나 약하게 나타내었다.
- 이 외에도 vanillic acid (10),37) gallic aldehyde (= 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde, 19)38) 및 salidroside (20)5)도 분리하였다. 이들의 구조는 분광학적 방법으로 확인 후 표준품들과 직접적으로 대조하여 확인하였으며, 이중 gallic aldehyde (19)를 제외한 3종의 화합물들은 Geum 속 식물로부터 처음 분리된 화합물들이다.1) 이 외에도 2종의 ellagic acid 유도체들이 분리되었다.
- 이상을 종합하여 화합물 3은 19α-hydroxy-2,3-secours-12- ene-2,3,28-trioic acid 3-methyl ester 즉 cecropiacic acid 3- methyl ester로 결정할 수 있었다.
- 이중 ursolic acid 3-acetate, cecropiacic acid 3-methyl ester, pomolic acid 3-acetate, ursonic acid, arjunic acid, kaji-ichigoside F1, vanillic acid, salidroside, ducheside B, emodin 및 (+)-dehydrovomifoliol은 Geum 속으로부터 처음으로 분리 보고된 성분들임을 확인하였으며, apigenin과 3,3'-di-O-methylellagic acid는 뱀무로부터 처음으로 분리된 성분임을 알았다.
- 장미과 식물인 뱀무의 전초로부터 25종의 화합물들을 단리하여 구조를 확인한 결과 10종의 ursane계 [ursolic acid 3-acetate, cecropiacic acid 3-methyl ester, pomolic acid 3- acetate, ursonic acid, ursolic acid, pomolic acid, corosolic acid, euscaphic acid, tormentic acid, 23-hydroxytormentic acid], 1종의 oleanane계 [arjunic acid] triterpenoid들과 2종의 saponin [rosamultin, kaji-ichigoside F1], 2종의 megastigmane [blumenol A, (+)-dehydrovomifoliol] 3종의 flavonoid [apigenin, isoquercitrin, tiliroside], 2종의 ellagic acid유도체들 [3,3'-di-O-methylellagic acid, ducheside B]과 3종의 phenol성 물질 [vanillic acid, gallic aldehyde, salidroside] 및 eugenol과 anthraquinone계 화합물인 emodin 으로 밝혔다.
- 즉 Fig. 3에서 볼 수 있는 바와 같이 C-4에 결합하고 있는 geminal CH3에 해당하는 signal들이 δ 1.23과 1.25에서 나타나며 이들은 모두 δ 181.7에서 나타나는 carboxylic acid methyl ester group (COOCH3)과 HMBC spectrum에서 correlation하고 있으며, δ 1.00에서 나타나고 있는 25-CH3 signal과 correlation하고 있는 C-1의 methylene proton [δ2.25 (1H, d, J = 18.4 Hz), 2.36 (1H, d, J = 18.4 Hz)]과 correlation하고 있는 COOH (δ 175.1)에 기인하는 13CNMR signal이 correlation하고 있는 것으로 보아 이 화합물의 A환은 2,3-seco type으로 되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 화합물 3과 16은 모두 triterpene계 임을 확인하였으며, 화합물 3은 δ 0.80 ~ 1.35사이에서 6개의 singlet CH3 signal들이 나타나며, δ 0.92에서 또 하나의 CH3가 doublet (J = 6.6 Hz)로 나타나고 있고 Table I에서 볼 수 있는 바와 같이 A환을 제외하고 B/C/D/E환의 13C-NMR chemical shift 값은 pomolic acid (8) 나 tormentic acid (18) 및 23-hydroxytormentic acid (21) 등과거의 일치하는 것으로 보아 19α-hydroxyursane계 화합물임을 추정하였다.
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