속단(Dipsaci Radix) 중 Asperosaponins 및 Iridoid glycosides의 LC-ESI-MS에 의한 동시분석 Simultaneous Determination of Asperosaponins and Iridoid Glycosides from Dipsaci Radix by Using LC-ESI-MS Spectrometry원문보기
Dipsaci Radix (Dipsacaceae) has been used as a tonic, an analgesic, anti-inflammatory and anti-complement agents in traditional herbal medicine for the therapy of low back pain, knee pain, rheumatic arthritis, traumatic hematoma, and bone fractures. A high-performance liquid chromatography-electrosp...
Dipsaci Radix (Dipsacaceae) has been used as a tonic, an analgesic, anti-inflammatory and anti-complement agents in traditional herbal medicine for the therapy of low back pain, knee pain, rheumatic arthritis, traumatic hematoma, and bone fractures. A high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometric method (HPLC-ESI-MS) was developed for the simultaneous quantitation method of the five compounds from the herbal drug: asperosaponin VI and asperosaponin XII (terpene glycosides), sweroside, loganin and dipsacus A(iridoid glycosides). HPLC separation of the analytes was achieved on a C18 column ($150{\times}2.0$ mm i.d., 5 ${\mu}m$) using the aqueous methanol containing 5 mM ammonium acetate with gradient flow of the mobile phase. Detection of the analytes was performed by positive ion electrospray ionization, and selected ion monitoring was used for data acquisition using m/z corresponding molecular adduct ion, $[M+NH_4]^+$ and $[M+H]^+$. Calibration graphs showed good linearity ($r^2$=0.9997) over the wide range of the analytes; intra- and inter-day precisions (RSD, %) were within 9.1% and the accuracy between 94.0-111.0%. Recoveries of the analytes through the assay procedure were in the range of 93.7-110.8%. Analytical results of the herbal drugs of Dipsaci Radix (17 samples) show wide distribution of the five marker compounds and clear difference of the species from Phlomidis Radix (4 samples). The developed method would provide a practical guide for the quality control of the herbal drug.
Dipsaci Radix (Dipsacaceae) has been used as a tonic, an analgesic, anti-inflammatory and anti-complement agents in traditional herbal medicine for the therapy of low back pain, knee pain, rheumatic arthritis, traumatic hematoma, and bone fractures. A high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometric method (HPLC-ESI-MS) was developed for the simultaneous quantitation method of the five compounds from the herbal drug: asperosaponin VI and asperosaponin XII (terpene glycosides), sweroside, loganin and dipsacus A(iridoid glycosides). HPLC separation of the analytes was achieved on a C18 column ($150{\times}2.0$ mm i.d., 5 ${\mu}m$) using the aqueous methanol containing 5 mM ammonium acetate with gradient flow of the mobile phase. Detection of the analytes was performed by positive ion electrospray ionization, and selected ion monitoring was used for data acquisition using m/z corresponding molecular adduct ion, $[M+NH_4]^+$ and $[M+H]^+$. Calibration graphs showed good linearity ($r^2$=0.9997) over the wide range of the analytes; intra- and inter-day precisions (RSD, %) were within 9.1% and the accuracy between 94.0-111.0%. Recoveries of the analytes through the assay procedure were in the range of 93.7-110.8%. Analytical results of the herbal drugs of Dipsaci Radix (17 samples) show wide distribution of the five marker compounds and clear difference of the species from Phlomidis Radix (4 samples). The developed method would provide a practical guide for the quality control of the herbal drug.
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문제 정의
1)의 HPLC-ESI-MS에 의한 동시분석법을 확립하고 validation하였다. 중국 및 국내 한약재 시장에서 입수한 한약재 시료 21종의 분석결과로부터 속단과 한속단의 구별 및 품질관리 기준을 제시하고자 하였다.
제안 방법
1차 표준물 혼합액으로 일정량 마이크로피펫으로 정확히 취하여 계열희석하고, 내부표준물 (digoxin. 10 µg/mL), 20 µL을 최종농도 500 ng/mL 되도록 각 검량용 표준물 혼합액에 첨가하였다.
HPLC-ESI-MS 분석법을 이용하여 한약재 '속단'으로부터 asperosaponin VI, asperosaponin XII, sweroside, loganin, 및 dipsanoside A의 동시분석법을 확립하고 validation하였다.
LC-MS 주입시 최종검액을 membrane filter (0.2 µm)를 통과시키고 이 중 5.0 µL를 주입하였다.
LCMS 분석은 보존용액 중 일부(1~5 mL)를 정확히 취하여 MeOH을 사용하여 정확하게 10 배 희석하여 작업용액으로 하고, 그중 25-µL aliquots를 1.0-mL 용량플라스크에 정확 하게 취하고, 내부표준용액(10 µg/mL), 20 µL 첨가하고 MeOH을 가하여 표선까지 채웠다(최종검액; final test solution).
검체분석 − 균질한 검체분말(50 mesh sieve 통과) 0.5 g에 해당하는 양을 25-mL 메스플라스크에 정확히 취하고 추출 용매(50% MeOH) 25mL를 가하여 눈금까지 채운 다음 상온에서 30 분간 초음파 추출하였다.
이 있고, 천속단을 그 성분으로 포함하는 한방복합제제의 품질관리를 위한 asperosaponin VI의 HPLC 및 HPLC-MS 분석28법만 보고되어 있을 뿐 속단에 포함되어 있는 서로 다른 계열 성분의 동시분석법에 관한 연구는 찾을 수 없다. 따라서 이 연구에서는 속단의 LC-TIC chromatograms을 검토하여 유의한 성분 피크로 확인된 asperosaponin VI, XII와 loganin, sweroside, dipsanoside A (Fig. 1)의 HPLC-ESI-MS에 의한 동시분석법을 확립하고 validation하였다. 중국 및 국내 한약재 시장에서 입수한 한약재 시료 21종의 분석결과로부터 속단과 한속단의 구별 및 품질관리 기준을 제시하고자 하였다.
0-mL 용량 플라스크에 이행시키고, 50% MeOH을 가하여 표선까지 채웠다(검체 보존용액: sample stock solution). 보존용액 중 일부분은 HPLC에 의해 용액 안정성 등을 검토하였다. LCMS 분석은 보존용액 중 일부(1~5 mL)를 정확히 취하여 MeOH을 사용하여 정확하게 10 배 희석하여 작업용액으로 하고, 그중 25-µL aliquots를 1.
분석법 검증 (Method Validation) − 분석법의 직선성, 검출 및 정량한계를 정하기 위한 검량선은 지표성분과 내부 표준물질의 면적비를 이용하였으며, LOD는 S/N=3, LOQ는 S/N=10을 기준으로 정하였다.
전 분석과정에 있어서의 회수율은 시료 중 포함될 것으로 추정되는 각 성분의 함량을 기준으로 10-100% 범위의 농도로 표준물을 첨가하여 조제한 QC sample 4 batch (1 control)에 대하여 각 5 회씩 분석하여 구하였다(Table V)과 같다. 각 성분의 회수율은 93.
분석법 검증 (Method Validation) − 분석법의 직선성, 검출 및 정량한계를 정하기 위한 검량선은 지표성분과 내부 표준물질의 면적비를 이용하였으며, LOD는 S/N=3, LOQ는 S/N=10을 기준으로 정하였다. 전 분석과정을 통한 분석의 일내 및 일간 정확성과 정밀성은 각 지표성분의 함량이 다른 세 농도로 첨가한 QC 검체를 만들어 그 분석결과로부터 구하였다. 정확성은 QC 검체에 spike한 표준물의 양과 표준물첨가법에 따라 측정한 값의 차이로부터 구하였다.
회수율은 임의검체(09D1016)의 작업용액으로부터 25 µL 취한 다음 asperosaponin VI (1)의 농도 각각 100-, 200-, 500 ng/mL, 나머지 성분들은 모두 50-, 100-, 200 ng/mL의 농도로 해당 성분의 최종 검체용액에 내부표준용액(10 µg/ mL) 20 µL을 모두 첨가하고, MeOH로 표시선까지 정확히 채운 후 vortex mix하고 membrane 여과한 다음 여액 중5 µL를 취하여 검량선법에 의해 분석결과를 구하였다.
대상 데이터
LC-MS 분석 − HPLC 분리컬럼은 C18 컬럼(Luna C18(2), 150×2.00 mm I.D., 5 µ, Phenomenex, Torrance, CA, USA), pre-column은 C18 cartridge (4.0 mmx2.0 mm, I.D.)을 사용 하였다.
LC-MS 분석의 내부표준물질(IS)로 사용한 digoxin은 Sigma-Aldrich(MSDS, Germany, ≥98.5%)로부터 구입하여 별도의 정제 없이 사용하였다(Fig. 1).
(Fairlawn, NJ, USA), ammonium acetate는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 그 외 실험에 사용한 모든 용매는 HPLC급을, 시약은 모두 분석급을 사용하였다. 탈이온 수는 J.
기기 − 본 연구에 사용한 LC-MS system은 Sciex API 3000 triple quadrupole mass spectrometer (Applied Biosystems, MDS Sciex, Concord, Canada)을 사용하였다.
1). 시료추출 및 분석에 사용한 methanol은 Fisher Scientific Co. (Fairlawn, NJ, USA), ammonium acetate는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 그 외 실험에 사용한 모든 용매는 HPLC급을, 시약은 모두 분석급을 사용하였다.
시험 재료 − 건조 한약재, 속단 13 종(09D1001-11, 19-21), 기공한 속단 4 종(鹽炙,09D1016-17; 酒炙, 09D1018-19) 은 중국 여러 지역(Sichuan, Guizhou, Anguo, Lanzhou)의 중약재 시장에서, 한속단 4종(09D1012-15)은 국내(영천, 제 천)의 한약재시장에서 한약감정 전문가(이재현 교수, 동국대)에 의해 제공 받아 시험재료로 사용하였다.
표준품 및 시약 − 본 연구에서 대상으로 한 표준품과 순도 (HPLC, %)는 다음과 같다: asperosaponin VI (1)(or akebia saponin D, >98%), asperosaponin XII (2, Hederagenin 3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1 → 3)-[β-D-glucopyranosyl- (1 → 4)]-D-glucopyranosyl-(1 → 3)-α-L-rhamnopyranosyl- (1 → 2)-α-L-arabinoside]-28-O-[β-D-glucopyranosyl-(1 →6)-β-D-glucopyranosyl]ester, >98%), sweroside (3, ≥96%), loganin (4, ≥97%), dipsanoside A (5, ≥96%). 이 표준품은 모두 천속단으로부터 분리 정제하여 HPLC에 의해 순도를 정한 것으로 모두 손건호교수(안동대학교)로부터 제공받았다. LC-MS 분석의 내부표준물질(IS)로 사용한 digoxin은 Sigma-Aldrich(MSDS, Germany, ≥98.
그 외 실험에 사용한 모든 용매는 HPLC급을, 시약은 모두 분석급을 사용하였다. 탈이온 수는 J.T.Baker (Phillipsbug, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
LC-ESI-SIM-MS 분석에서 지표성분은 모두 양이온 검출법을 채택하였으며 선택적이온 검출방법(selective ion monitoring: SIM)법을 이용하여 분석하였다. LC-SIM-MS의 최적 operation parameter는 Table I과 같다.
전 분석과정을 통한 분석의 일내 및 일간 정확성과 정밀성은 각 지표성분의 함량이 다른 세 농도로 첨가한 QC 검체를 만들어 그 분석결과로부터 구하였다. 정확성은 QC 검체에 spike한 표준물의 양과 표준물첨가법에 따라 측정한 값의 차이로부터 구하였다.
성능/효과
Ai)의 뿌리를 정품으로 규정하였다.4,5) 속단속 식물(Dipsacus genus)은 전 세계적(유럽, 북미, 아프리카 및 아시아)으로 20 여종이 분포하며, 그 뿌리 및 잎은 약용으로 활용되었다. 이 전에 D.
HPLC-SIM-MS 분석 − Fig. 4(A)의 TIC에서 확인된 5 성분에 대한 동시분석의 최적조건을 탐색하기 위하여 이동상용매 및 조성비, gradient flow 조건을 달리하여 최적 분리 조건을 검토한 결과 MeOH (5mM ammonium acetate)을 이동상 용매로 사용할 때 분리도 및 검출감도 면에서 가장 양호한 결과를 보였다.
MRM mode에 의한 [M+NH4]+등과 같은 q1 이온들을 CID(collisonally induced dissociation)에 의한 분해이온 스펙트라 (q3 ion spectra)를 검토한 결과 terpenoid- 및 iridoid glycosides 성분들은 여러 개의 당분자(sugar moiety)를 포함하여 특징적 조각이온 보다 여러 가지 분해이온들이 복잡하게 나타났으며, dipsanoside A (5)와 asperosaponin XII (2)의 경우 이온화 감도가 매우 낮았다. 속단에는 당이 여러개 다양하게 결합된 saponins 성분들이 미량으로 많이 포함되어 있으므로, 분석법의 선택성 면에서 MRM법에 의하기보다 SIM법이 유리하다고 사료되었다.
4(A)의 TIC에서 확인된 5 성분에 대한 동시분석의 최적조건을 탐색하기 위하여 이동상용매 및 조성비, gradient flow 조건을 달리하여 최적 분리 조건을 검토한 결과 MeOH (5mM ammonium acetate)을 이동상 용매로 사용할 때 분리도 및 검출감도 면에서 가장 양호한 결과를 보였다. 검토한 성분들의 분자이온 검출의 최적 SIM parameter는 Table II와 같으며 실험부에 기술한 gradient 조건에서 IS 포함 6 성분은 모두 30분 이내에 완전 분리되었다(Fig. 5). 한편 내부표준물로 사용한 digoxin (IS) 의 검출(m/z 798, [M+NH4]+ )에 방해되는 속단성분은 없는 것으로 사료되었다.
5% HAc), AcCN (5 mM NH4Ac)를 검토한 결과, infusion 용매로써, MeOH (5 mM NH4Ac)을 사용하여 양이온 검출법에서 분자이온 피크의 감도가 가장 높은 결과를 나타내었다. 검토한 성분은 모두 낮은 이온화 에너지(DP)에서 molecular adduct ion, [M+NH4]+이 검출되고, 높은 이온화 에너지에서는 [M+Na]+이온이 검출되었다. 단, sweroside (3)의 경우 [M+H]+이온의 강도가 높은 것으로 확인되었다(Fig.
HPLC-ESI-MS 분석법을 이용하여 한약재 '속단'으로부터 asperosaponin VI, asperosaponin XII, sweroside, loganin, 및 dipsanoside A의 동시분석법을 확립하고 validation하였다. 본 분석결과로부터 속단(천속단)과 한속단의 이화학적 감별이 용이하였다. 이 분석법은 위 성분들을 지표로 한 속단의 품질관리와 향후 시험기준법 개정에 활용될 것으로 사료된다.
속단성분의 (-)ESI-MS 스펙트라 − 속단 성분의 ESI-MS spectra를 측정하기 위해 infusion 용매로써 MeOH (0.5% HAc), MeOH (5 mM NH4Ac), AcCN (0.5% HAc), AcCN (5 mM NH4Ac)를 검토한 결과, infusion 용매로써, MeOH (5 mM NH4Ac)을 사용하여 양이온 검출법에서 분자이온 피크의 감도가 가장 높은 결과를 나타내었다.
MRM mode에 의한 [M+NH4]+등과 같은 q1 이온들을 CID(collisonally induced dissociation)에 의한 분해이온 스펙트라 (q3 ion spectra)를 검토한 결과 terpenoid- 및 iridoid glycosides 성분들은 여러 개의 당분자(sugar moiety)를 포함하여 특징적 조각이온 보다 여러 가지 분해이온들이 복잡하게 나타났으며, dipsanoside A (5)와 asperosaponin XII (2)의 경우 이온화 감도가 매우 낮았다. 속단에는 당이 여러개 다양하게 결합된 saponins 성분들이 미량으로 많이 포함되어 있으므로, 분석법의 선택성 면에서 MRM법에 의하기보다 SIM법이 유리하다고 사료되었다.
따라서 천속단의 경우 asperosaponin VI 외에 asperosaponin XII와 sweroside, dipsanoside A도 속단의 약효, 분류 및 품질과 관련하여 monitoring 해야 할 것으로 사료되었다. 위 분석결과로부터 속단(천속단)과 한속단의 이화학적 감별은 간단히 이루어지지만, 속단 생산 각 지역을 구분하여 확보한 다수의 검체분석 결과로부터 원산지 확인 및 보다 엄격한 품질관리도 가능할 것으로 사료되었다.
후속연구
6(B)에서 iridoids 계 3 성분은 서로 상관관계가 없는 것으로 보인다. 따라서 천속단의 경우 asperosaponin VI 외에 asperosaponin XII와 sweroside, dipsanoside A도 속단의 약효, 분류 및 품질과 관련하여 monitoring 해야 할 것으로 사료되었다. 위 분석결과로부터 속단(천속단)과 한속단의 이화학적 감별은 간단히 이루어지지만, 속단 생산 각 지역을 구분하여 확보한 다수의 검체분석 결과로부터 원산지 확인 및 보다 엄격한 품질관리도 가능할 것으로 사료되었다.
본 분석결과로부터 속단(천속단)과 한속단의 이화학적 감별이 용이하였다. 이 분석법은 위 성분들을 지표로 한 속단의 품질관리와 향후 시험기준법 개정에 활용될 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
속단이란 무엇인가?
속단(Dipsaci Radix; Xuduan in Chinese)은 골절치료에 주로 사용한 전통중의약(Traditional Chinese Medicine:TCM) 이다.1-3) 근골의 절상을 치유하는 의미로 이름 붙여진 ‘杜夢’ 과 유사한 효과를 보이는 생약도 동일한 이름으로 사용한바, 중국에서는 D.
천속단 뿌리는 어떤 효과를 가지고 있는가?
이 전에 D. Asper Wall1)로도 알려진 천속단 뿌리는 섬유근종의 치료에 사용되었을 뿐만 아니라, 최근에는 알츠하이머에 대한 약리 효과도 보고되었다.6) 전 세계의 약용식물 374 종에 대한 in vitro 종양세포 치사효과의 스크리닝 결과6), 천속단은 고용량 복용해도 부작용이 없는 Class 1 herb로 분류되었다 (AHPA-BSH:The American Herbal Products AssociationBotanical Safety Handbook).
천속단이 동속의 유사식물로부터 유래된 한약재나 위품들이 유통될 가능성이 큰 이유는 무엇인가?
천속단은 우리나라에서는 생산되지 않고 주로 Hubei, Sichuan, Guizou, Yunnan, and Tibet 등 중국 서남부 산악지역에서 자생 또는 재배되고 있으므로,1) 그 수요는 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 따라서 동속의 유사식물로부터 유래된 한약재나 위품들이 유통될 가능성이 크다.
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