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문제 정의
- 느티만가닥버섯의 재배적인 단점인 재배기간이 길어지는 단점을 개선하기 위해 신품종 육종을 수행하였고 그 결과 재배기간이 100일(배양기간 80일, 버섯생육기간 20)로 단축되고 쓴맛이 적은 품종들이 개발되었으며[17], 개발된 품종의 재배에 적합한 배지재료를 탐색하고 효소의 활성과 버섯 품질과의 연관관계를 구명하여 버섯 신품종 육종 과정 중에서 많은 시간을 소요하는 실증재배의 기간을 단축하기 위하여 신품종과 모균주의 endo-celluar enzyme과 exo-cellular enzyme의 활성을 측정하고 효소활성과 실증재배를 통해 재배된 버섯과의 연관관계를 구명하기 위한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 버섯의 생리적, 형태적인 특성검증에 대한 실증재배는 850 cc polypropylene bottle에 pine sawdust (23%), concob (32%), rice bran (32%), soybean hull (22%)를 혼합하여 살균전 수분을 65%로 조절하여 충진하고 99℃ 에서 6 hr동안 상압살균과 20℃로 냉각한 후, 15 ml의 액체종균(soybean power 0.3%, sucrose 3%, MgSO4·7H2O 0.05%, KH2PO4 0.05%)을 접종한 후, 실내온도 20℃, 상대습도 75%, CO2 3,000 ppm에서 60일, 70일, 80일, 90일, 100일 동안 배양하여 실내온도 15℃, 상대습도 98%, CO2 3,000 ppm에서 재배를 수행하였다.
- 버섯의 형태적 특징은 갓의 넓이(cap width, CW), 갓의 두께(cap thickness, CT), 버섯대의 길이(stalke length, SL), 버섯대의 두께(stalke thickness, ST), 병당 수확량(Yield, YD), 유효경수(number of validity stalke, NS)의 6가지의 항목으로 측정을 실시하였다. 그 결과 갓의 크기는 Hm15-5과 Hm17-5균주가 각각 1.
- 이러한 특징들로 인해 extracellular enzyme의 활성도를 간편하게 검증하기 위하여 chromogenic media를 이용 방법으로 Proteins, xylan, starch, lipid등을 분해하는 유용한 효소를 생산하는 것으로 잘 알려진 Penicillium [18]의 extracellular enzyme 활성도를 chromogenic 반응으로 검증하였고[24], Ophiostoma와 Leptographium의 Cellulolytic 활성을 탐색하였다[7]. 특히, 재배기간이 3년 이상이 소요되어 신품종 육종에 오랜 시간이 소요되는 표고버섯(Lentinula edodes)의 육종 효율을 증진시키기 위해 우수한 성능을 가진 단핵균사의 선발을 위해 포자들의 생화학적인 특성을 간편하게 검증하기 위해 단핵균사들의 extracellular enzyme 활성을 검증하는 연구가 보고되어 있다[13].
- 특히 Hm15-3을 제외하고는 신품종들에서는 배양 80일을 기준으로 하여 배양일수가 90일, 100일과 비교하여도 재배일수는 20일 전후로 큰 차이를 나타내지 않아 적정 배양일수를 80일로 선정하고 버섯의 형태적인 특성을 측정하기 위한 실험을 진행하였다.
- 확보된 20개 각각의 균주는 3×3 mm 조각을 잘라내어 PDA plate에 1 cm 간격을 두고 동시에 접종하여 24℃에서 7일 동안 배양한 후, 현미경 검경을 실시하여 clamp connection이 있는 균주를 이핵 균사로 판단하고 선발하여 실증재배를 실시하였다.
- Hm3-10과 Hm1-1 균주로부터 채집된 포자를 1개의 plate에 30~40개의 포자가 배양될 수 있도록 희석법을 통해 조절하였다. 희석된 spore 희석액을 plate에 포자를 도말한 후, 24℃에서 4일 동안 배양한 후, 독립되어 발아된 균사를 각각 150개씩 채취하여 PDA 배지에 계대배양하여 24℃에서 10일 동안 배양한 후, 현미경 검경을 통하여 clamp connection이 없는 균사를 단핵균사로 판단하여 균총의 모양과 균사의 상태를 관찰하여 각각 20개씩을 확보하였다(Fig. 2). 확보된 20개 각각의 균주는 3×3 mm 조각을 잘라내어 PDA plate에 1 cm 간격을 두고 동시에 접종하여 24℃에서 7일 동안 배양한 후, 현미경 검경을 실시하여 clamp connection이 있는 균주를 이핵 균사로 판단하고 선발하여 실증재배를 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 느티만가닥버섯(H. marmoreus) 균주는 9종으로 육종 모균으로 사용된 Hm3-10 (덕유산에서 수집된 야생종), Hm1-1 (일본에서 상업적으로 재배되고 있는 품종), 재배특성 검증을 위해 사용된 Hm6-6 (만가닥 2호, MIKACC51996)과 Hm3-10과 Hm1-1을 모균으로 하여 단핵균사 교배를 통해 육종된 신품종 Hm15-3, Hm15-4, Hm15-5, Hm16-1, Hm16-2, Hm17-5을 사용하였다(Fig. 1). 각 균주는 potato-dextrose agar (PDA) 배지에 계대배양한 후, 보관하여 실험에 사용되었다.
- 이것은 동일한 종의 버섯일지라도 한국에서 채집된 종과 일본에서 재배종인 균주간의 유연관계가 멀기 때문인 것으로 판단된다. 총 343개의 균주를 85일 배양하여 전술한 재배방법으로 실증재배를 실시하여 병당수확량(yield per bottle), 버섯갓의 색깔(color of cap), 재배일수(growing day), 버섯유효경수(대길이가 13 cm 이상인 버섯, number of validity stalke), 쓴맛(bitterness), 갓의 형태(Cap shape)의 6가지 기준으로 1차 선발을 실시하여 58개 균주를 선발하였고, 선발된 58개 균주를 2차 재배를 실시하여 목표특성에 적합한 6개의 균주를 선발하여 각각 Hm15-3, Hm15-4, Hm15-5, Hm16-1, Hm16-2, Hm17-5로 명명하였다(Table 1, Fig. 1D, E, F, G, H, I). 선발된 6개의 균주를 배양일수가 120일 소요되어 국내에서 1990년대에 재배되었지만 현재는 재배되지 않고 있으나, 국내에 품종등록이 되어있는 Hm6-6(만가닥 2호)을 대조품종으로 하여 배양일수 60일, 70일, 80일, 90일, 100일에 따른 재배실험을 실시한 결과 배양일수가 길어짐에 따라 대조품종과 새로 개발된 신품종 6종 모두에서 재배일수가 줄어드는 결과를 나타내었다(Table 2).
이론/모형
- α-amylase, β-glucosidase, CMCase, Xylanase의 활성도 측정은 각각Danielsson 방법[4], Tokao 방법[20], Kanda 방법[10]과 Kim 방법[11]을 사용하였으며, 환원당의 측정은 dinitrosalicylic acid (DNS)를 사용하였다[18].
- α-amylase, β-glucosidase, CMCase, Xylanase의 활성도 측정은 각각Danielsson 방법[4], Tokao 방법[20], Kanda 방법[10]과 Kim 방법[11]을 사용하였으며, 환원당의 측정은 dinitrosalicylic acid (DNS)를 사용하였다[18]. Chitinase의 활성도 측정은 우선 colloidal chitin을 Hsu and Lockwood [6]의 방법으로 제조하였고, 제조된 colloidal chitin을 이용하여 Jeong and Lee [9]의 방법으로 수행하였다. 그리고 1 unit는 1분 동안 1 umol의 환원당(glucose)이 생성되는 양으로 정의하였다.
- Hm3-10과 Hm1-1 균주로부터 채집된 포자를 1개의 plate에 30~40개의 포자가 배양될 수 있도록 희석법을 통해 조절하였다. 희석된 spore 희석액을 plate에 포자를 도말한 후, 24℃에서 4일 동안 배양한 후, 독립되어 발아된 균사를 각각 150개씩 채취하여 PDA 배지에 계대배양하여 24℃에서 10일 동안 배양한 후, 현미경 검경을 통하여 clamp connection이 없는 균사를 단핵균사로 판단하여 균총의 모양과 균사의 상태를 관찰하여 각각 20개씩을 확보하였다(Fig.
- 각각의 crude enzyme solution은 액체질소탱크에 보관하여 실험에 사용하였다. 단백질량은 bovine serum albumin (BSA)을 이용하여 Bradford method를 사용하였다 [1].
성능/효과
- 6개의 신품종들의 exo-cellular 효소 활성도에서는 Hm16-1균주에서 α-amylase, CMCase, Xylanase의 활성도가 모균주와 다른 5개의 새로운 균주들에 비해 높게 측정되었다.
- Exo-cellular 효소 활성도는 α-amylase의 specific activity가 5,292~1,184 unit/mg protein으로 가장 높았으며, CMCase의 specific activity가 1,140~245 unit/mg protein으로 α-amylase 다음으로 높은 활성도를 나타내었으며, Xylanase의 specific activity는 94~575 unit/mg protein이었으나, β-glucosidase, chitinase의 활성은 상대적으로 적었다.
- 버섯의 형태적 특징은 갓의 넓이(cap width, CW), 갓의 두께(cap thickness, CT), 버섯대의 길이(stalke length, SL), 버섯대의 두께(stalke thickness, ST), 병당 수확량(Yield, YD), 유효경수(number of validity stalke, NS)의 6가지의 항목으로 측정을 실시하였다. 그 결과 갓의 크기는 Hm15-5과 Hm17-5균주가 각각 1.3 cm와 1.6 cm로써 적었으며, 나머지 균주들은 1.9~2.2 cm로써 큰 차이를 나타내지 않았다. 버섯대의 굵기는 대조구를 포함한 모든 균주들에서 0.
- 그래서 본 연구에서 CMCase와 β-glucosidase의 효소 활성도를 측정한 CMCase의 활성도는 높았으나, β-glucosidase의 효소활성도가 낮은 것으로 측정되었다.
- 그러나 대조품종인 Hm6-6품종은 60일과 100일 배양을 비교하였을 때 재배일수는 각각 34일과 26일을 나타내어 배양기간이 40일 길어질 때에 재배일수는 8일 줄어드는 결과를 나타내었으나, 새로 개발된 신품종에서는 Hm15-3을 제외하고는 배양 80일 이상일 때, 재배기간이 19~22일 소요되어 새로 개발된 신품종이 기존의 대조 품종에 비해 재배회전율을 높일 수 있을 것으로 판단된다.
- 덕유산에서 채집한 국내 야생종 균주인Hm3-10과 일본 재배종인 Hm1-1균주에서 각각 생장속도와 균총의 형태가 서로 다른 20개의 단핵균사를 선발하여 교배를 실시한 결과 총 400개의 교배 균주 중에서 343개의 이핵 균사를 확보하여 85.8%의 교배율을 나타내었다[17]. 일반적인 4극성 균주간 교배에서 나타나는 25%에 비해 상당히 높은 교배율을 나타내었다.
- 1D, E, F, G, H, I). 선발된 6개의 균주를 배양일수가 120일 소요되어 국내에서 1990년대에 재배되었지만 현재는 재배되지 않고 있으나, 국내에 품종등록이 되어있는 Hm6-6(만가닥 2호)을 대조품종으로 하여 배양일수 60일, 70일, 80일, 90일, 100일에 따른 재배실험을 실시한 결과 배양일수가 길어짐에 따라 대조품종과 새로 개발된 신품종 6종 모두에서 재배일수가 줄어드는 결과를 나타내었다(Table 2).
- 7 cm로써 유사하였다. 수확량은 Hm16-1균주에서 133 g으로 가장 낮았으며, 각각159 g, 155 g이 수확된 Hm16-1, Hm15-4균주가 우수하였고, 나머지 균주들은 145~147 g으로 유사하였으며, 버섯의 유효경수를 측정한 자료에서는 Hm15-3, Hm15-4, Hm17-5균주에서 각각 11, 11, 12개가 측정되었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 버섯의 형태적 특징으로 판단할 때는 재배일수, 유효경수, 수확량 측면에서 우수한 Hm15-3, Hm15-4, Hm17-5균주가 재배품종으로 적합한 것으로 판단된다(Table 3).
- 육종에 사용된 모균주 Hm3-10과 Hm1-1균주와 새로 개발된 6개의 균주들의 endo-, exo-cellular 효소활성도를 측정한결과, endo-cellular 효소 활성도는 α-amylase의 specific activity가 73.9 (Hm17-5)~102.2 (Hm16-1) unit/mg protein으로 가장 높았으며, Chitinase의 specific activity가 8.1 (Hm15-4)~13.1(Hm16-1) unit/mg protein이었으며 β-glucosidase, CMCase, Xylanase의 specific activity는 거의 없었다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 버섯의 형태적 특징으로 판단할 때는 재배일수, 유효경수, 수확량 측면에서 우수한 Hm15-3, Hm15-4, Hm17-5균주가 재배품종으로 적합한 것으로 판단된다(Table 3).
- 8%의 교배율을 나타내었다[17]. 일반적인 4극성 균주간 교배에서 나타나는 25%에 비해 상당히 높은 교배율을 나타내었다. 이것은 동일한 종의 버섯일지라도 한국에서 채집된 종과 일본에서 재배종인 균주간의 유연관계가 멀기 때문인 것으로 판단된다.
- 효소 활성도만으로 판단할 때는 Hm16-1균주가 가장 우수한 것으로 판단되지만 형태적, 생리적 특성을 고려하여 종합적으로 판단한 결과 효소활성이 높은 것이 반드시 형태적, 생리적 특성이 우수한 품종의 선발 요건은 아닌 것으로 판단된다. 그러나 대표적인 목재 분해 효소들인 β-glucosidase, CMCase, Xylanase의 exo-cellular 효소 활성도와 버섯 품질과의 연관성은 더욱 연구되어야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 대표적인 목재 분해 효소들인 β-glucosidase, CMCase, Xylanase의 exo-cellular 효소 활성도와 버섯 품질과의 연관성은 더욱 연구되어야 할 것으로 생각된다.
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