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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 배·급수 관망의 모사 실험 장치에 형성된 생물막으로부터 시간에 따른 초기 미생물 군집의 동적 변화를 추적하고 궁극적으로 생물막 형성을 지연 또는 제어하기 위해 target으로 해야 할 대상을 확인하고자 하였다.
- , 2000; Bachmann and Edyvean, 2006). 본 연구에서는 각각의 재질별(STS 304, PVC, PE)로 초기 생물막 형성이 감지되는 시간이 각 수도관 재질의 표면 조도 값(Ra)과 어떤 상관관계를 갖는지 알아보았다.
- 수도관 재질에 따른 생물막 군집의 다양성과 재질 및 시간에 따른 유사성 분석은 생물막 군집분석에서 얻어진 electropherogram의 결과에 기초하여 수행하였다. 우선 phylotype richness (S)는 전체 T-RF 중 구별되는 T-RF 길이를 갖는 phylotype의 수로 나타내었다.
제안 방법
- 5 bp 이내의 차이를 보이는 peak을 동일 peak으로 규정하고 검출된 peak 하나를 하나의 미생물로 간주하였다. ABR에서 시편의 회수는 12시간 간격을 기본으로 하였으나, 초기 수도관내 생물막 형성 메커니즘의 규명에서 pioneer의 검출이 중요하여 이들이 검출될 수 있도록 반응기 가동시간을 점차 줄이면서 모니터링 하였다. STS 304 재질에서는 반응기 가동 후 6시간이 경과되었을 때 최초 211 bp의 T-RF를 갖는 pioneer가 검출되었으며(Fig.
- PCR 산물은 0.8 % agarose gel에 전기영동하여 관찰한 후에 AccuPrep PCR purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였으며, Biodoc Analyzer (Biometra, Netherlands)에서 1 kb ladder (Promega, Germany)를 이용하여 정량하였다.
- PCR 조건은 DNA template 5 μL, 1X reaction buffer, 1.5 mM MgCl2 , 200 μM dNTP, 0.2 μM primer, 5% DMSO, 1 ~ 40 μg/μL bovine serum albumin, 그리고 1 unit Taq polymerase (Takara, Japan)를 혼합하여 최종부피 50 μL로 핵산 증폭기(My CyclerTM, Bio-Rad)를 이용하여 95 ℃ initial denaturation 5 min, 94 ℃ denaturation 1 min, annealing 55 ℃ 1 min, 72 ℃ extension 2 min을 30 cycle 수행한 뒤, 72 ℃ final extension 10 min을 수행하여 증폭하였으며 양성/음성 대조군도 함께 확인하였다.
- T-RFLP 분석을 통해 얻어진 T-RF profile을 이용하여 각각의 수도관 재질에서 시간 경과에 따라 형성되는 생물막 군집의 다양성 관련 지표들을 평가하여 초기 수도관내 생물막 군집의 기능적 특성 및 재질에 따른 군집 특성 차이를 분석하였다. 실험에 사용된 세 가지 재질(STS, PVC, PE) 모두에서 시간의 경과에 따라 생물막 군집의 종풍부도를 나타내는 richness (S)가 48시간을 경계로 급격히 증가하는 현상이 뚜렷이 관찰되었다(Fig.
- AOC의 측정은 ATCC로부터 구입한 표준 균주인 Pseudomonas fluorescens strain P-17과 Aquaspirillum sp. strain NOX 균주를 이용하여 분석하였다(Lehtola et al., 2004).
- 각각의 시료에서 reproducible peak 만을 numerical analysis에 사용하였으며 ±0.5 bp 이내의 차이를 보이는 peak을 동일 peak로 규정하였다.
- 실험에 사용된 시편의 재질은 STS 304(stainless steel 304), PVC (polyvinyl chloride), PE (polyethylene)이며, ABR에 장착이 가능하도록 제작하여 사용하였다. 각각의 재질은 표면 조도를 비교 분석하기 위해 1x1x1(cm)로 절단한 시편을 AFM (Atomic Force Microscopy)을 이용하여 측정하였다. 표면 조도 파라미터로서 평균 조도(Ra ; roughness average, arithmetic mean of the surface roughness)를 비교하였으며 이는 조도 곡선에서 기준길이 전체에 걸쳐 평균선에서 벗어나는 모든 peak과 valley의 편차 평균값을 표면 조도로 사용하였다.
- 각기 다른 재질의 수도관에서 초기 생물막 형성의 메커니즘을 알아보기 위해 T-RFLP 분석을 수행하였다. 사용된 제한효소는 Hha I(GC▼GC)이며, ±0.
- 따라서 본 연구에서는 실험 목적에 맞게 준비하기 위해 pore size 0.2 μm, 25 mm의 polycarbonate membrane (Poretics, USA)으로 여과하고 멸균된 수술용 가위로 잘게 잘라 microcentrifuge tube에 넣은 뒤 분석할 때까지 -70 ℃에서 보관하였다.
- 이때 전기의 생물막 군집은 1 ∼ 20일 시료와 27 ∼ 94일 시료로 더욱 세분화되어 clustering되는 결과를 보여 주었다. 또한 상대적인 종풍부도의 변화에 있어서는 256일까지 계속 감소하다가 다시 증가하는 일종의 천이현상을 관찰하였다. 이와는 달리 본 연구는 생물막 형성 초기 단계에서 미생물 군집의 천이를 추적하고 제어대상 미생물 군집을 확인했다는 점에서 의미가 있다.
- 반응기는 실험을 수행하기 전에 멸균(121 ℃, 15 psi, 15 min)하여 사용하였으며, inner drum에 설치되는 각 수도관 재질의 시편은 에탄올로 3회, 증류수로 3회씩 각각 세척한 후 설치하였다. 반응기내로 유입되는 수돗물의 유량은 3.36 L/h였으며, 수리학적 체류시간은 0.3 h, 그리고 전단력은 0.48 N/m2가 되도록 설정하여 운전하였다.
- 5 mm)로 되어 있어 20개의 시편을 장착할 수 있다. 반응기는 실험을 수행하기 전에 멸균(121 ℃, 15 psi, 15 min)하여 사용하였으며, inner drum에 설치되는 각 수도관 재질의 시편은 에탄올로 3회, 증류수로 3회씩 각각 세척한 후 설치하였다. 반응기내로 유입되는 수돗물의 유량은 3.
- 수돗물의 수질은 Standard Method(APHA, 2005)에 준하여 분석하였으며 분석 항목은 pH, 탁도, 잔류염소, 온도, 암모니아성 질소, 인산염 인, AOC (assimilable organic carbon)등 총 7가지 항목을 검사하였다. 분석에 있어서 pH는 pH meter (Fisher Scientific, AR15)로, 탁도는 Turbidity meter (Fisher Scientific, Inc., DRT-15CE)를 이용하여 측정하였다. 잔류염소량은 N,N-diethylp-phenylenediamine ferrous titrimetric method로 분석하였고, 암모니아성 질소와 인산염 인의 농도는 각각 Phenate method와 Ascorbic acid method를 이용하여 분석하였다.
- , 1994). 이러한 문제점을 최소화하기 위해 생물막 회수시 설치된 복수의 시편을 모두 회수하여 분석에 사용하였다. 시편의 회수는 에탄올에 담가둔 핀셋을 화염멸균 한 후 사용하였으며, 회수된 시편은 0.
- 정제된 PCR 산물은 제한효소 Hha I (Promega)을 제조사의 방법에 따라 처리하였으며, 생성된 말단제한절편의 크기는 Solgent (Korea)에 의뢰하여 자동염기서열분석장치 (Model 377, Applied Biosystems Instrument)로 확인하였다. 생물막 시료의 TRF profile에서 30 bp 보다 작거나 800 bp 보다 큰 TRFs는 분석에서 제외하였다.
- 표면 조도 파라미터로서 평균 조도(Ra ; roughness average, arithmetic mean of the surface roughness)를 비교하였으며 이는 조도 곡선에서 기준길이 전체에 걸쳐 평균선에서 벗어나는 모든 peak과 valley의 편차 평균값을 표면 조도로 사용하였다.
- 9 % NaCl 용액이 담겨져 있는 culture tube에 넣고 sonicator (Bransonic Ultrasonic Cleaner, Model 2210)로 sonics mode 5 min, vortex mixing 2 min을 3회 반복한 뒤 cell scraper로 수 회 긁어서 회수하였다. 회수된 생물막 시료는 분자생물학적 분석을 위해 DNA 추출 전 시료를 원심분리 하는 것을 지양하였다. 이는 시각적으로 확인 가능한 pellet을 찾기가 힘들고, 상대적으로 양이 적으며, 시료의 손실이 크기 때문이었다.
- 회수된 생물막 형성 미생물의 16S rRNA 유전자는 labeled forward primer 27F (5’- Hexachlorofluorescein-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 reverse primer 1518R (5’-AAGGAGGTGATCCANCCRCA-3’)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭시켰다.
대상 데이터
- , USA)는 배·급수관의 수리학적 흐름을 모사할 수 있을 뿐만 아니라 미생물이 부착할 수 있는 기저표면을 제공하여 유체의 흐름과 접촉하는 표면에 형성되는 생물막을 지속적으로 모니터링 할 수 있는 장치이다. ABR의 구성은 유리 재질의 outer cylinder (I.D. 156 mm x H180 mm)와 polycarbonate 재질의 회전형 inner drum (O.D. 140 mm x H155 mm), 그리고 반응기 상부에 설치된 모터와 모터의 속도를 조절할 수 있는 제어판으로 구성되어 있다. Slide section의 표면은 홈(slot) 형태(15 mm x 145 mm x 1.
- 반응기 내부로 유입되는 수돗물에는 어떠한 처리도 하지 않고 실험실로 공급되는 수돗물을 직결하여 사용하였다. 수돗물의 수질은 Standard Method(APHA, 2005)에 준하여 분석하였으며 분석 항목은 pH, 탁도, 잔류염소, 온도, 암모니아성 질소, 인산염 인, AOC (assimilable organic carbon)등 총 7가지 항목을 검사하였다.
- 사용된 제한효소는 Hha I(GC▼GC)이며, ±0.5 bp 이내의 차이를 보이는 peak을 동일 peak으로 규정하고 검출된 peak 하나를 하나의 미생물로 간주하였다.
- 실험에 사용된 시편의 재질은 STS 304(stainless steel 304), PVC (polyvinyl chloride), PE (polyethylene)이며, ABR에 장착이 가능하도록 제작하여 사용하였다. 각각의 재질은 표면 조도를 비교 분석하기 위해 1x1x1(cm)로 절단한 시편을 AFM (Atomic Force Microscopy)을 이용하여 측정하였다.
데이터처리
- Similarity distance를 측정하기 위해 계산된 coefficients 값들은 similarity matrix로 만들어 cluster analysis를 수행하였으며 SPSS, XLstat (AddinSoft SARL), Mega 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 수도관 재질과 시간 경과에 따른 생물막 군집의 유사성 비교는 Jaccard coefficients (Sj)를적용하여 다음과 같이 계산하였다.
이론/모형
- 우선 phylotype richness (S)는 전체 T-RF 중 구별되는 T-RF 길이를 갖는 phylotype의 수로 나타내었다. 군집다양성은 Shannon-Weaver diversity index (H)로 다음 식을 이용하여 구하였다.
- 반응기 내부로 유입되는 수돗물에는 어떠한 처리도 하지 않고 실험실로 공급되는 수돗물을 직결하여 사용하였다. 수돗물의 수질은 Standard Method(APHA, 2005)에 준하여 분석하였으며 분석 항목은 pH, 탁도, 잔류염소, 온도, 암모니아성 질소, 인산염 인, AOC (assimilable organic carbon)등 총 7가지 항목을 검사하였다. 분석에 있어서 pH는 pH meter (Fisher Scientific, AR15)로, 탁도는 Turbidity meter (Fisher Scientific, Inc.
- 여과를 통해 회수된 생물막 시료로부터 Rochelle et al. (1992)의 방법으로 핵산을 추출하였다. 우선 시료에 200 μL의 0.
- , DRT-15CE)를 이용하여 측정하였다. 잔류염소량은 N,N-diethylp-phenylenediamine ferrous titrimetric method로 분석하였고, 암모니아성 질소와 인산염 인의 농도는 각각 Phenate method와 Ascorbic acid method를 이용하여 분석하였다. AOC의 측정은 ATCC로부터 구입한 표준 균주인 Pseudomonas fluorescens strain P-17과 Aquaspirillum sp.
성능/효과
- 1. 수질분석을 통해 측정된 AOC 농도(37.3μg/L)는 자체만으로는 생물막 형성을 제어하기 어려운 수준이었으며, 수돗물에 접촉시킨 후 3시간 만에 PVC 시편에서 T-RF profile을 관찰할 수 있었다.
- 2. AFM 분석으로 측정한 평균 조도가 가장 높은 PVC 시편에서 가장 먼저 T-RF peak이 관찰되었으나 STS와 PE의 경우는 재질 표면의 조도가 생물막 형성 시간을 결정하는 유일한 요인은 아니었다.
- 3. T-RF peak의 변화를 추적한 결과 재질에 상관없이 48시간 까지는 종풍부도와 군집다양성, 우점도 등이 낮았으나 이후 빠르게 증가하는 경향을 볼 수 있었다.
- 4. Cluster 분석을 통해 생물막 미생물의 군집 구조를 비교했을 때 재질보다는 접촉시간에 따라 뚜렷한 2개의 그룹으로 나누어졌으며 생물막 형성을 지연시키거나 제어할 대상인 pioneer 군집이 초기 48시간의 짧은 시간에 형성되는 것을 확인하였다.
- AFM 측정 결과, STS 304의 경우 금속재료의 압출과정에서 고온, 고압에 의해 발생되는 grain(결정입자)과 grain boundary(결정입자 경계)가 나타남을 볼 수 있었다(Fig. 3). Grain을 가로 질러 긁힘과 블로홀(blowhole)이 관찰되었으며, grain 사이의 경계(boundary)에서는 틈(crack)이 관찰되었다.
- ABR에서 시편의 회수는 12시간 간격을 기본으로 하였으나, 초기 수도관내 생물막 형성 메커니즘의 규명에서 pioneer의 검출이 중요하여 이들이 검출될 수 있도록 반응기 가동시간을 점차 줄이면서 모니터링 하였다. STS 304 재질에서는 반응기 가동 후 6시간이 경과되었을 때 최초 211 bp의 T-RF를 갖는 pioneer가 검출되었으며(Fig. 1), PVC와 PE 재질에서는 각각 3시간과 12시간이 경과된 후 205 bp의 T-RF가 검출되었다(결과 미제시). 모든 경우에서 초기 T-RF 출현 이후 시간이 경과됨에 따라 군집의 구성이 역동적(dynamic)으로 변화하였다.
- 01 mg/L로 증가시켰을 때는 모형 수도관에 형성된 생물막에 지대한 영향을 미쳤음을 보고하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 수돗물의 수질 상태로 판단할 때 질소의 경우는 안전한 수준으로 판단되나 인의 경우는 경계해야 할 농도 수준으로 생각된다. 특히 분석에 사용된 수돗물처럼 많은 양의 유기탄소를 함유한 수돗물에서는 인이 미생물 생장에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Miettinen et al.
- 본 연구에서 AOC는 평균 35 μg/L 수준으로 측정되어 위 문헌에서 제안한 종속영양세균의 생장을 제한할 수 있는 농도를 초과하므로 생물학적 안정성을 확보하기 위해서는 잔류염소의 존재가 필수적인 상황으로 판단된다(Table 1).
- , 2003). 분석된 시료에서 우점도 경향은 시간이 경과할수록 특정 종에 의한 우점도가 낮아지는 경향을 보여주었다(Fig. 2C).
- 수돗물에 노출된 시간의 경과와 수도관 재질에 따라 형성된 생물막 군집의 유사성 분석 결과, 초기 생물막 형성 시 플라스틱 재질인 PVC와 PE 재질에서 형성된 생물막 군집의 유사성이 금속 재질인 STS 304와 비교할 때 상대적으로 높게 나타났다(Fig. 4). 한편 시간 경과에 따른 군집의 차이는 매우 뚜렷하게 2개의 cluster로 나누어지는 것을 볼 수 있었다.
- T-RFLP 분석을 통해 얻어진 T-RF profile을 이용하여 각각의 수도관 재질에서 시간 경과에 따라 형성되는 생물막 군집의 다양성 관련 지표들을 평가하여 초기 수도관내 생물막 군집의 기능적 특성 및 재질에 따른 군집 특성 차이를 분석하였다. 실험에 사용된 세 가지 재질(STS, PVC, PE) 모두에서 시간의 경과에 따라 생물막 군집의 종풍부도를 나타내는 richness (S)가 48시간을 경계로 급격히 증가하는 현상이 뚜렷이 관찰되었다(Fig. 2A). 생물막 형성 미생물 군집의 다양성을 나타내는 Shannon-Weaver diversity index (H)는 그 수치가 높을수록 구성원이 다양함을 의미하는데, 세 가지 재질 모두에서 역시 시간이 경과함에 따라 증가하였다(Fig.
- 아크릴, 유리, 그리고 철로 된 시편을 in situ 상태의 바닷물에 접촉시키고 3∼ 15시간 간격으로 초기 36시간 동안의 군집구조를 분석한 결과에서 시편의 재질은 군집구조에 큰 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로부터 수도관 내 초기 생물막 군집의 변화는 우선 pioneer가 관 표면에 부착되어 우점하지만 시간이 경과함에 따라 군집을 구성하는 생물막 형성 미생물의 수가 점차 증가하며, 군집의 구조가 다양화되면서 군집내 미생물들은 점차 균등화됨을 알 수 있다. 즉 수도관 내벽에서 초기 생물막 형성은 단순하지만 점차 복잡하면서 안정한 형태를 향하여 진행됨을 반영한다.
- 9 nm)로 각각 측정되었다. 즉 실험에 사용된 수도관 재질 중 PVC 재질이 상대적으로 표면 평균 조도가 가장 높았으며, PE ≃ STS 304로 나타났다. 평균 조도 값이 가장 큰 PVC 재질에서 가장 신속하게(3 h) T-RF가 검출되기 시작한 것은 이들 사이의 높은 상관관계를 의미하지만, 표면 조도 값이 비슷하게 나타났음에도 불구하고 STS 304와 PE 재질에서는 STS 304 (6 h)가 PE (12 h) 재질보다 상당히 빠르게 생물막이 형성되었다.
- 즉 실험에 사용된 수도관 재질 중 PVC 재질이 상대적으로 표면 평균 조도가 가장 높았으며, PE ≃ STS 304로 나타났다. 평균 조도 값이 가장 큰 PVC 재질에서 가장 신속하게(3 h) T-RF가 검출되기 시작한 것은 이들 사이의 높은 상관관계를 의미하지만, 표면 조도 값이 비슷하게 나타났음에도 불구하고 STS 304와 PE 재질에서는 STS 304 (6 h)가 PE (12 h) 재질보다 상당히 빠르게 생물막이 형성되었다. 이러한 결과로부터 만약 재질별로 평균 조도 값의 차이가 상당히 크다면 초기 생물막의 형성속도에 있어서 어느 정도 차이를 유발할 수 있으나, 평균 조도 값이 유사한 경우에는 재질 자체가 갖는 다른 요인들에 의해 조절되는 것으로 판단된다.
- 한편 본 연구에 사용된 수돗물에서 측정된 암모니아성 질소와 인산염 인의 평균 농도는 각각 0.02와 0.008 mg/L로 나타났다(Table 1). 따라서 탄소:질소:인의 비율을 감안하면 탄소가 미생물의 재생장을 제한하는 주된 제한요인(limiting factor)이 되고 있음을 보여준다.
후속연구
- 본 연구에서 AOC는 평균 35 μg/L 수준으로 측정되어 위 문헌에서 제안한 종속영양세균의 생장을 제한할 수 있는 농도를 초과하므로 생물학적 안정성을 확보하기 위해서는 잔류염소의 존재가 필수적인 상황으로 판단된다(Table 1). 많은 연구에서 수돗물의 수질분석시 유기탄소를 COD (Martiny et al., 2003), TOC (White et al., 2011), 또는 DOC (Eichler et al., 2006)의 농도로 제시하고 있으나 이러한 유기탄소의 상당부분이 세균이 동화하여 이용할 수 없는 부분이라는 점을 감안한다면 AOC에 대한 분석 결과가 제시되어야 할 것이다.
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