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문제 정의
- 씨감자는 각종 병원체로부터 감염의 가능성이 높아 씨감자 재배 및 파종은 정부에서 관리하고 있으며 농가에 보급 당시 감염씨 감자를 걸러내기 위해서 노동력에 의존한 육안선별을 실시하고 있다. 따라서 본 연구에서는 정상 씨 감자에 주요한 병해 피해를 발생시키는 세균 및 곰팡이를 접종하여 분광분석으로 판별 가능성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
- 선별된 씨감자는 씨눈 주변에 흙이 묻어 있어 곰팡이, 세균 등의 서식지가 되기 쉬워 세척 및 살균과정을 수행하여 교차오염을 방지하고자 하였다. 접종 전 살균과정은 NaClo 200배희석액에 20분간 침지시킨 후 멸균수로 2회 세척하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 토양에서 서식하여 심각한 문제를 야기하는 세균 및 곰팡이균들 중 감자둘레 썩음병, 감자무름병을 유발시키는 병원성 세균인 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum과 검은무늬 썩음병과 반쪽 시들음병을 유발하는 곰팡이균인 Rhizoctonia solani, Verticillium albo-atrum을 정상 씨 감자에 접종한 후 씨감자에 발생된 부패 및 썩음 등의 현상을 반사 방식의 분광분석 기법을 이용하여 감염씨감자의 비파괴검사 가능성을 조사하였다.
- 전체의 시료는 멸균된 용기에 거름종이를 깔고 수분을 유지하기 위하여 증류수를 넣어 각각의 균주별로 최적의 온도를 설정한 후 인큐베이터에 보관하였다. 각각의 시료는 저장 동안 반사 스펙트럼을 3～4회 측정하였다. 세균은 빠르게 감염이 진행되어 10일 동안 3회를 측정하였고, 곰팡이의 경우 15일 동안 4회를 측정하였다.
- 감염씨감자의 시료 제작은 소독된 칼을 이용하여 씨감자를 절반으로 절단한 다음 각각의 균을 100 ㎕씩 내부에 접종한 후 원래의 씨감자 형태로 접합하였다. 전체의 시료는 멸균된 용기에 거름종이를 깔고 수분을 유지하기 위하여 증류수를 넣어 각각의 균주별로 최적의 온도를 설정한 후 인큐베이터에 보관하였다.
- 개발된 예측 모델로 정상과 감염씨감자의 판별정확도를 나타낼 수 있게 된다. 데이터는 60%:40% 비율로 training set과 testing set으로 나눈 후 training set에 의해 모델을 개발한 후 testing set에 적용하여 정확도를 판정하였다. PLS-DA는다변량분석소프트웨어(unscrambler v9.
- 자연적으로 씨감자에 발생되는 세균 및 곰팡이균은 병징의 진행 정도를 확인하기 어려우며 대부분이 여러 종의 세균 및 곰팡이가 씨감자에서식하게 되어 병원체의 종류를 확인하기 어렵다. 따라서 단일균을 배양하여 직접 씨감자에 접종하는 방법을 선택하였다. 접종에 이용한 세균으로는 무름병을 유발하는 P.
- 각각의 표에는 전처리 별로 개발된 모델의 결정계수와 SEC를 나타내었으며, 모델의 검증 결과의 결정 계수와 SEP를 나타내었다. 또한 각각의 정상과 감염 씨감자의 판별 정확도를 나타내었다. Table 2는 정상 씨감자와 P.
- 본 연구에서는 정상 씨감자로부터 감염 씨감자를 판별하기 위하여 정상 씨감자의 종속변수를 임의의 값 “0”으로 지정하였고 감염된 씨감자의 종속변수는 “1”의 값으로 지정하였다.
- 각각의 시료는 저장 동안 반사 스펙트럼을 3～4회 측정하였다. 세균은 빠르게 감염이 진행되어 10일 동안 3회를 측정하였고, 곰팡이의 경우 15일 동안 4회를 측정하였다.
- 전처리 기법을 적용한 후 정상씨감자와 감염된 씨감자를 판별하기 위하여 PLS-DA로 분석하였다. PLS-DA와 PLS는 동일한 방법으로서 PLS의 경우 스펙트럼과 종속변수(independent variables)인 실제 측정된 값과의 관계를 회귀 모델로 개발하고 예측하는 방법이지만 PLS-DA의 경우 종속 변수를 임의의 변수(dummy variables)로 지정하여 회귀 모델을 개발하고 예측하게 된다(Woo 등, 1999; Min과 Kang, 2008; Lim 등, 2011; Alexandrakis 등, 2008).
- 획득한 반사 스펙트럼은 처음과 끝부분의 노이즈와 관련된 부분을 제외하고 500～1000 nm를 분석에 이용하였다. 정상 및 감염씨감자의 반사 스펙트럼은 주성분 분석(principal component analysis; PCA)을 이용하여 outlier를 제거한 후 나머지를 분석하였다. Fig.
대상 데이터
- solani를 배양한 후 정상씨 감자에 접종하였다. Table 1은 Korea Agricultural Culture Collection(KACC) 에서 분양받은 균주를 나타내었다. 세균 및 곰팡이 종류별로 제작된 시료 개수는 총 220개이며 P.
- michiganensis subsp. sepedonicus에 감염시킨 씨감자 50개, R. solani에 감염시킨 씨감자 50개, V. albo-atrum에 감염시킨 씨감자 40개를 제작하였다. 비교를 위해 정상 씨 감자 30개를 준비하였다.
- michiganensis subsp. sepedunicus을 선택하였고 곰팡이로는 R. solani, V. albo-atrum을 선택하여 직접 씨감자에 접종하고 저장 동안 병징을 유도하여 반사 스펙트럼을 획득하였다. 획득한 스펙트럼은 PLS-DA 다변량 분석 기법과 전처리 기법을 적용하여 예측 모델을 개발하고 판별정확도를 분석하였다.
- 1과 같이 스펙트로미터(S-3100, sinco, Korea)와 적분구를 이용하여 400～1100 nm 영역의 반사 스펙트럼을 획득하였다. 반사 스펙트럼은1 nm의 해상도이며 실시간 8회 스캔된 평균값을 이용하였다. 반사 스펙트럼의 반사율은 White reference와 Dark reference를 측정하였고 식 1을 이용하여 반사율로 계산하여 구하였다.
- 반사 스펙트럼의 측정에는 Fig. 1과 같이 스펙트로미터(S-3100, sinco, Korea)와 적분구를 이용하여 400～1100 nm 영역의 반사 스펙트럼을 획득하였다. 반사 스펙트럼은1 nm의 해상도이며 실시간 8회 스캔된 평균값을 이용하였다.
- 본 연구에서 사용된 씨감자는 강원도 감자종자진흥원으로부터 포장재배되어 바이러스나 다른 병원 체 감염이 없는 씨감자를 구입하였다. 실험실에 이송된 후 표면의 상처가 없고 씨눈이 자라지 않은 신선한 상태의 씨감자를 선별하였다.
- ), SEC(standard error of calibration), SEP(standard error of prediction), bias 등을 고려하여 예측 모델의 성능을 평가하게 된다. 본 연구에서는 우수한 예측 모델을 결정하기 위하여 결정 계수가 높고 SEC, SEP가 낮은 모델을 선정하였다(Kim 등, 2011).
- albo-atrum에 감염시킨 씨감자 40개를 제작하였다. 비교를 위해 정상 씨 감자 30개를 준비하였다.
- 본 연구에서 사용된 씨감자는 강원도 감자종자진흥원으로부터 포장재배되어 바이러스나 다른 병원 체 감염이 없는 씨감자를 구입하였다. 실험실에 이송된 후 표면의 상처가 없고 씨눈이 자라지 않은 신선한 상태의 씨감자를 선별하였다. 씨감자 접종에 사용된 병원균은 토양에서 서식하는 세균 및 곰팡이로 씨감자 재배 및 저장 동안 종서에 발생하기 쉬운 병원체이다.
- 획득한 반사 스펙트럼은 처음과 끝부분의 노이즈와 관련된 부분을 제외하고 500～1000 nm를 분석에 이용하였다. 정상 및 감염씨감자의 반사 스펙트럼은 주성분 분석(principal component analysis; PCA)을 이용하여 outlier를 제거한 후 나머지를 분석하였다.
데이터처리
- albo-atrum을 선택하여 직접 씨감자에 접종하고 저장 동안 병징을 유도하여 반사 스펙트럼을 획득하였다. 획득한 스펙트럼은 PLS-DA 다변량 분석 기법과 전처리 기법을 적용하여 예측 모델을 개발하고 판별정확도를 분석하였다. 각각의 세균 및 곰팡이를 접종한 검증 결과에서 C.
이론/모형
- 데이터는 60%:40% 비율로 training set과 testing set으로 나눈 후 training set에 의해 모델을 개발한 후 testing set에 적용하여 정확도를 판정하였다. PLS-DA는다변량분석소프트웨어(unscrambler v9.7, Camo Co., Norway)를 이용하였다.
- , 2000).본 연구에서는 평균(mean), 최대값(maximum), 일정 범위 값(range)의 정규화(normalization) 전 처리 방법과 스펙트럼의 측 정 당시 환경 변화에 기인한 스펙트럼 기준선의 이동을 보정하기 위하여 1차 미분과 2차 미분 전 처리 기법을 적용하였다.
- 획득한 스펙트럼은 시료의 불규칙한 형상과 시료 자체의 구성 성분에 따라 광산란, 광경로의 변화가 발생하므로 수학적인 전처리 기법을 적용하여 스펙트럼을 보정하고 안정적인 예측 모델을 개발하는 데 이용한다(Ryu et al., 2000).본 연구에서는 평균(mean), 최대값(maximum), 일정 범위 값(range)의 정규화(normalization) 전 처리 방법과 스펙트럼의 측 정 당시 환경 변화에 기인한 스펙트럼 기준선의 이동을 보정하기 위하여 1차 미분과 2차 미분 전 처리 기법을 적용하였다.
성능/효과
- 138의 SEP가 확인되었다. Table 4의 R. solani에 감염된 씨감자를 판별하는 PLS-DA의 결과는 2차 미분의 전처리에서 검증 결과가 가장 우수하였으며 이때의 결정 계수는 0.867이고, 0.0.173의 SEP가 확인되었다. Table 5의 V.
- michiganensis subsp. sepedunicus 에감염된 씨감자의 판별 성능이 가장 우수하였다. 이는 정규화를 이용한 전처리는 형상의 차이에 의해 발생되는 스펙트럼의 변이를 최소화하고 각각의 그룹들 간의 스펙트럼의 특징을 구분하는 데 효과적으로 작용하였기 때문으로 판단되었다.
- michiganensis subsp. sepedunicus를 접종한씨감자 PLS-DA의 결과가 가장 우수한 결정 계수가 확인되었으며 이때의 판별 정확도는 정상 씨감자와 감염씨감자 모두 100%였고 오차를 포함한 정확도의 경우 정상 씨감자는 97.5%이고 감염씨감자는 100%였다.
- michiganensis subsp. sepedunicus에 감염된 씨감자를 판별하는 PLS-DA 의 결과에서도 가장 우수한 예측 결과는 평균을 이용한 정규화 전 처리에서 확인되었으며, 0.922의 결정 계수와 0.138의 SEP가 확인되었다. Table 4의 R.
- 이는 정규화를 이용한 전처리는 형상의 차이에 의해 발생되는 스펙트럼의 변이를 최소화하고 각각의 그룹들 간의 스펙트럼의 특징을 구분하는 데 효과적으로 작용하였기 때문으로 판단되었다. 또한 실험에서 병징의 현상이 빠르게 진행되고 정상 씨 감자와 감염 씨감자의 구별이 뚜렷한 세균을 접종한 감염씨감자의 판별 성능이 우수한 것으로 판단할 수 있었다.
- 5보다 높으면 감염씨감자인 Class II의 그룹으로 판단하였다(Alexandrakis 등, 2008).본 연구에서 개발된 모델의 분석 결과에서는 예측값이 0.5로 어느 그룹에도 속하지 않는 결과를 나타내는 uncertain value는 없었으며 정상 씨감자를 감염씨감자 그룹으로 판별하는 false positive와 감염 씨감자를 정상 씨감자로 판별하는 false negative는 나타나지 않았다.
- 6%를 제외하고 100%이었으며, 이는 오차를 제외한 결과 값이었다. 오차를 포함한 판별 정확도의 경우 1～3개 정도의 false positive와 false negative가 나타났으므로 감염씨감자의 판별 정확도는 모두 90% 이상이었다.
- 측정된 반사스펙트럼에는 클로로필의 영역으로 알려진 680 nm 영역의 흡수가 확인되었으며 960 nm 수분 흡수 영역이 관찰되었다(EIMary 등, 2008).특히 V. alboatrum을 접종한 감염씨감자를 제외한 저장기간의 경과에 따라 스펙트럼의 변화가 관찰되는데 클로로필의 영역이 약해지면서 기울기가 가파른 형태의 반사 스펙트럼이 확인되었다. 이러한 변화는 감염 부위를 중심으로 갈 변 현상과 함몰 현상의 영향으로 스펙트럼의 흡수율이 변했기 때문이라 판단되었다.
후속연구
- 씨감자 선별 기술로 국내에서는 아직 시도되지 않은 감염씨감자 판별을 위한 기초실험을 수행하여 가능성을 평가하였고, 향후 씨감자의 위치에 상관없이 자연 발생된 병징의 판별 성능에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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