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문제 정의
- albicans 및 항생제 내성 Candida sp.에 대한 신규의 항균제 개발 가능성을 확인하였다. 본 연구 결과는 해조류 특히 패, 넓패, 알송이모자반, 야마다모자반이 다양한 세균 및 항생제 내성진균의 제어를 위한 생물자원으로 개발 가능함을 제시하고 있다.
- 에 대해 in vitro 항균 활성을 평가하였으며, 그 결과 패 및 넓패에서 우수한 항세균 활성과 항생제 다제내성 Candida sp. 의 제어가능성을 확인하였기에 이에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 대조구로는 항세균제인 ampicillin 및 항진균제인 miconazole(Sigma Co., USA)를 각각 1 µg/disc 농도로 사용하였으며, 3회 이상 평가 후 생육억제환 지름의 대표 결과를 mm 단위로 나타내었다[27].
- albicans 및 Candida sp.에 대해 항균력을 평가하였다(Table 4). 대조구로 사용된 miconazole(1 µg/ disc)은 다양한 항생제 내성균주에 대해 7.
- 즉, 준비된 해조류들은 이물질을 제거하고 수돗물로 세척한 후 실온에서 음건하고 이를 믹서기로 분쇄한후 건조분말 해조류를 제조하였으며, 건조분말 100 g당 1리터의 메탄올을 가한 후 상온에서 2일 추출하고, 이를 4회 반복한 후 추출액을 모아 50℃에서 감압 농축하여 추출물을 제조하였다. 조제된 추출물은 dimethylsulfoxide(DMSO)를 이용하여 100 mg/mL 농도로 조정하여 항균활성을 평가하였다. 한편 항균 활성이 우수한 패, 넓패, 알쏭이모자반, 야마다모자반 감태, 곰피, 대황 및 톳의 8종의 경우, 메탄올 추출물로부터 n-hexane, ethylacetate, butanol을 이용하여 순차적 유기용매 분획물과 이후의 물 잔류물을 조제한 후, 각각의 분획물을 대상으로 항생제 내성 P.
- 각각의 해조류 메탄올 추출물은 이미 보고한 바와 동일하게 제조하였다[1]. 즉, 준비된 해조류들은 이물질을 제거하고 수돗물로 세척한 후 실온에서 음건하고 이를 믹서기로 분쇄한후 건조분말 해조류를 제조하였으며, 건조분말 100 g당 1리터의 메탄올을 가한 후 상온에서 2일 추출하고, 이를 4회 반복한 후 추출액을 모아 50℃에서 감압 농축하여 추출물을 제조하였다. 조제된 추출물은 dimethylsulfoxide(DMSO)를 이용하여 100 mg/mL 농도로 조정하여 항균활성을 평가하였다.
- 5 mm)에 가한 후 세균의 경우 24시간, 진균의 경우 48시간 배양 후, 생육억제환의 크기를 측정하여 평가하였다[26]. 특히 Asepergillus niger에 대한 항균 활성은 Potato dextrose broth(Difco Co., USA)를 이용하여 균사체 생육억제 활성을 평가하였다. 대조구로는 항세균제인 ampicillin 및 항진균제인 miconazole(Sigma Co.
- 항세균 및 항진균 활성 평가는 기존의 보고한 discdiffusion방법[26]과 동일하게 이용하였으며, 세균의 경우 Nutrient agar(Difco Co., USA), 진균의 경우 Sabouraud dextrose agar(Difco Co. USA) 배지상에서 다양한 시료 5µL를 멸균 disc-paper(Whatsman No. 2, 지름 6.5 mm)에 가한 후 세균의 경우 24시간, 진균의 경우 48시간 배양 후, 생육억제환의 크기를 측정하여 평가하였다[26].
- 해양생물 유래의 기능성 물질 개발 연구의 일환으로, 35종 해조류로부터 메탄올 추출물을 조제하여 항생제 내성균 주를 포함한 다양한 세균 및 진균에 대한 항균력을 평가하였다. 그 결과, 패, 넓패, 알쏭이모자반 및 야마다모자반에서 광범위한 세균에 대해 우수한 항세균 활성을 확인하였으며, 상기 4종과 함께 곰피, 대황, 감태 및 톳의 8종에서 Candida albicans 생육억제력을 확인하였다.
- 해조류 추출물의 실제적 이용 가능성과 급성독성평가의 일환으로 각각의 추출물을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였다. 500 µg/mL 농도에서 20% 이상의 용혈활성을 나타낸 시료는 넓패, 패, 야마다모자반, 포도송이해초 및 납작파래의 5종이었다(Table 3).
- 해조류 추출물의 실제적 이용가능성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4% v/v)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다[27]. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 µL를 96-well microplate(Greiner Bio-one, flat bottom, Germany)에 가하고 시료용액 100 µL를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰다.
대상 데이터
- coli H7:O157, Salmonella typhimurium), 그람양성 세균 2종(Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) 및 진균 3종(Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger)을 사용하였다 (Table 2). 그람음성 세균 중 P. aeruginosa는 항생제 내성균 주를 포함한 7종류, 진균 중 Candida albicans는 항생제 내성균주를 포함한 7종류를 사용하였으며, 각각의 미생물들은 한국미생물자원센터(KCTC), 한국농용 미생물보존센터(KACC), 일본 Institute for Fermentation, Osaka (IFO) 및 한국 항생제 내성 균주은행(CCARM: Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes)에서 분양 받아 사용하였다. P.
- 본 실험에 사용된 해조류들은 갈조류 17종(불레기말, 쇠 미역, 감태, 곰피, 대황, 톳, 넓패, 패, 다시마, 알송이모자반, 모자반, 짝잎모자반, 괭생이모자반, 지충이, 야마다모자반, 고리매 및 미역), 홍조류 11종(돌가시리, 진두발, 도박, 참도박, 개도박, 얼룩도박, 방사무늬김, 작은구슬산호말, 붉은까막살, 마디잘록이 및 코도니) 및 녹조류 7종(매생이, 청각, 잎파래, 납작파래, 구멍갈파래, 잘피 및 포도송이해초)의 35종으로 Table 1에 나타내었다. 이중 코토니는 인도네시아에서, 포도송이해초는 베트남에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 33종은 국내 부산, 경남, 전남 등지에서 구입하여 사용하였다[1].
- 본 실험에 사용한 균주는 그람음성 세균 4종(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, E. coli H7:O157, Salmonella typhimurium), 그람양성 세균 2종(Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) 및 진균 3종(Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger)을 사용하였다 (Table 2). 그람음성 세균 중 P.
- Korea)하여 상등액 100 µL를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 microplate reader기(Sunrise-Basic, Tecan, Austria) 를 이용하여 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%), 실험 대조구로는 triton X-100 (0.1%)을 사용하였다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
- 본 실험에 사용된 해조류들은 갈조류 17종(불레기말, 쇠 미역, 감태, 곰피, 대황, 톳, 넓패, 패, 다시마, 알송이모자반, 모자반, 짝잎모자반, 괭생이모자반, 지충이, 야마다모자반, 고리매 및 미역), 홍조류 11종(돌가시리, 진두발, 도박, 참도박, 개도박, 얼룩도박, 방사무늬김, 작은구슬산호말, 붉은까막살, 마디잘록이 및 코도니) 및 녹조류 7종(매생이, 청각, 잎파래, 납작파래, 구멍갈파래, 잘피 및 포도송이해초)의 35종으로 Table 1에 나타내었다. 이중 코토니는 인도네시아에서, 포도송이해초는 베트남에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 33종은 국내 부산, 경남, 전남 등지에서 구입하여 사용하였다[1]. 각각의 해조류 메탄올 추출물은 이미 보고한 바와 동일하게 제조하였다[1].
성능/효과
- 8종 해조류 추출물 및 이들의 각각의 분획물들은 500 µg/disc 농도에서 생육억제환을 평가한 결과, 강력한 활성을 나타내지는 않았다.
- aeruginosa에 대해 항세균활성을 나타내는 해조류는 없었다. E. coli에 대해서는 넓패, 패, 다시마, 알쏭이모자반, 모자반, 짝잎모자반, 야마다모자반, 매생이 및 납작파래가 우수한 항균활성을 나타내었고, 이 중 패에서 생육억제환이 19.1 mm로 가장 크게 나타났다. 한편 E.
- 3 mm 이상의 강한 생육억제활성을 보였다. L. monocytogenes에 대해서는 쇠미역, 감태, 곰피, 대황, 톳, 넓패, 패, 다시마, 지충이, 야마다모자반, 고리매, 미역, 작은구슬산호말, 참도박, 포도송이해초, 청각, 납작파래, 잎 파래 및 구멍갈파래의 19종의 해조류가 7.5 mm 이상의 생육억제환을 나타내는 항균활성을 나타내었다. 전체적으로 패와 넓패가 다양한 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었으며, 특히 패의 S.
- 3 mm)을 나타내었다. S. aureus에 대해서는 톳, 넓패, 패, 알쏭이모자반, 모자반, 짝잎모자반, 괭생이모자반, 지충이, 야마다모자반 추출물에서 항균성을 나타내었고, 그 중 짝잎모자반에서 16.3 mm 이상의 강한 생육억제활성을 보였다. L.
- coli에 대한 항균활성과 일치하지는 않았다. S. typhimurium을 대상으로 항균력을 검사한 결과 넓패, 패, 알쏭이모자반, 도박, 방사무늬김, 납작파래 및 잎파래에서 항균활성을 나타내었고, 잎파래의 경우 매우 강력한 생육억제력(20.3 mm)을 나타내었다. S.
- 해양생물 유래의 기능성 물질 개발 연구의 일환으로, 35종 해조류로부터 메탄올 추출물을 조제하여 항생제 내성균 주를 포함한 다양한 세균 및 진균에 대한 항균력을 평가하였다. 그 결과, 패, 넓패, 알쏭이모자반 및 야마다모자반에서 광범위한 세균에 대해 우수한 항세균 활성을 확인하였으며, 상기 4종과 함께 곰피, 대황, 감태 및 톳의 8종에서 Candida albicans 생육억제력을 확인하였다. 이중 패, 넓패, 야마다모자반 추출물은 500 µg/mL 농도에서 55-93%의 인간적혈구 용혈활성을 나타내었다.
- 대조구로 사용된 miconazole(1 µg/ disc)은 다양한 항생제 내성균주에 대해 7.0~28.0 mm의 생육억제환을 나타내었으나, C. albicans KCTC 7965, C. albicans CCARM 14020 및 CCARM 14021, C. krusei CCARM 14017, C. tropicalis CCARM 14019에 대해서는 항균활성이 나타나지 않았다.
- 대조구로 사용된 항세균제 ampicillin은 1 µg/disc 농도에서 P. aeruginosa, E. coli H7:O157을 제외한 세균에 대해 우수한 생육억제효과를 나타내었으며, 항진균제 miconazole은 동일농도에서 S. cerevisiae, C. albicans 및 A. niger에 대해 양호한 항진균 활성을 나타내었다.
- 8종 해조류 추출물 및 이들의 각각의 분획물들은 500 µg/disc 농도에서 생육억제환을 평가한 결과, 강력한 활성을 나타내지는 않았다. 먼저 곰피의 경우 유기용매 분획물에서는 거의 활성이 나타나지 않았고, 물 잔류물에서만 항진균 활성이 나타났다. 이는 곰피의 항진균 활성 성분이 수용성 물질임을 의미하며, 차후 곰피 물 잔류물에 대한 항진균 활성물질 탐색이 필요하다고 판단된다.
- niger에 대해 항곰팡이 활성을 나타내는 해조류는 없었다. 전반적으로 홍조류보다는 갈조류 및 녹조류 추출물에서 우수한 항균활성이 나타났으며, 특히 넓패 및 패에서 항진균 활성이 나타났다.
- 5 mm 크기로 미약하였다. 제빵 및 양조에 사용되는 S. cerevisiae에 대해서는 패와 넓패에서만 항진균활성이 나타났으며, A. niger에 대해 항곰팡이 활성을 나타내는 해조류는 없었다. 전반적으로 홍조류보다는 갈조류 및 녹조류 추출물에서 우수한 항균활성이 나타났으며, 특히 넓패 및 패에서 항진균 활성이 나타났다.
- 반면 넓패의 경우 hexane 분획물에서 항균활성이 나타났다. 톳의 경우 butanol 분획 및 물 잔류물에서 주로 활성이 나타났으며, 알쏭이모자반의 경우 hexene 분획을 제외한 다양한 분획에서 우수한 활성이 나타났다. 마지막으로 야마다모자반의 경우 butanol 분획 및 물 잔류물에서 항생제 내성균주에 대해 항진균 활성을 나타내었다.
- 500 µg/mL 농도에서 20% 이상의 용혈활성을 나타낸 시료는 넓패, 패, 야마다모자반, 포도송이해초 및 납작파래의 5종이었다(Table 3). 특히 넓패, 패 및 야마다모자반은 각각 93.01, 92.63 및 55.90%의 높은 용혈활성을 나타내어 이들 추출물을 식품에 고농도로 사용하는 경우 부작용이 나타날 가능성을 예측할 수 있었다.
- 1 mm로 가장 크게 나타났다. 한편 E. coli H7:O157에 대해서는 톳, 넓패, 패, 알쏭이모자반, 모자반, 짝잎모자반, 괭생이모자반, 지충이, 포도송이해초, 잎파래 및 구멍갈파래가 항균성을 나타내었고, 그 중 패와 괭생이모자반에서 15.4 mm 이상의 강한 항균활성을 보였다. 그러나 E.
- 한편 상기 8종 해조류 메탄올 추출물 및 이들의 각각의 분획물을 대상으로 항생제 내성균주를 포함한 다양한 P.aeruginosa 균주에 대한 항균력을 평가하였으나, 시험균주 모두에서 항균활성이 나타나지 않았다(result not shown). 본 연구결과는 해조류, 특히 패, 넓패, 알송이 모자반, 야마다모자반이 다양한 세균 및 항생제 내성진균의 제어에 이용될 수있는 유용생물자원으로의 가능성을 제시하고 있으며, 향후 각각의 해조류로부터 실제적 이용가능성 검토를 위한 활성 물질의 규명 및 항균기작 연구가 필요하다.
후속연구
- 이는 지구 표면적의 70%를 차지하는 해양에는 지구 생물 종의 80% 이상의 다양한 생물종이 서식하고 있으며, 다양한 해양생물들은 육상생물과는 전혀 다른 생활환경으로 인해 특이한 생리활성물질을 보유하고 있기 때문이다[4,16]. 따라서 광범위한 해양생물자원의 유용 생리활성평가에 따른 생물소재 개발연구가 지속적으로 필요하며, 특히 한국의 경우 세계 4위의 생산량을 가지는 해조류[4]에 대한 보다 적극적인 생리활성 연구 및 산업적 이용 연구가 필요하다.
- 에 대한 신규의 항균제 개발 가능성을 확인하였다. 본 연구 결과는 해조류 특히 패, 넓패, 알송이모자반, 야마다모자반이 다양한 세균 및 항생제 내성진균의 제어를 위한 생물자원으로 개발 가능함을 제시하고 있다.
- aeruginosa 균주에 대한 항균력을 평가하였으나, 시험균주 모두에서 항균활성이 나타나지 않았다(result not shown). 본 연구결과는 해조류, 특히 패, 넓패, 알송이 모자반, 야마다모자반이 다양한 세균 및 항생제 내성진균의 제어에 이용될 수있는 유용생물자원으로의 가능성을 제시하고 있으며, 향후 각각의 해조류로부터 실제적 이용가능성 검토를 위한 활성 물질의 규명 및 항균기작 연구가 필요하다.
- 먼저 곰피의 경우 유기용매 분획물에서는 거의 활성이 나타나지 않았고, 물 잔류물에서만 항진균 활성이 나타났다. 이는 곰피의 항진균 활성 성분이 수용성 물질임을 의미하며, 차후 곰피 물 잔류물에 대한 항진균 활성물질 탐색이 필요하다고 판단된다. 대황 및 감태의 경우에는 butanol 분획물에서 일부 활성이 나타났다.
- 마지막으로 야마다모자반의 경우 butanol 분획 및 물 잔류물에서 항생제 내성균주에 대해 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 상기의 8종 해조류, 특히 패 및 넓패로부터 C. albicans 및 항생제 내성 Candida sp에 대한 신규의 항균제 개발 가능성을 제시하고 있다.
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