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문제 정의
- 본 연구에서는 IAA 생성량이 다른 균주들을 선발하여 그들의 IAA 생성경로 중 nitrile 전환경로를 비교하여 각 균주의 IAA생성량과 nitrile 전환효소 활성 간에 상호연관성이 있는지 조사하였다. 또한 nitrilase 등에 의한 nitrile 전환능을 비교하여 cyanide 분해능 등으로 특화 가능성을 제시하였다.
제안 방법
- IAA 생성균주들의 IAA 생합성 경로를 파악하기 위해 총 21개 분리균주 중 nitrile 전환효소 활성을 가지면서 IAA 생성능이 크게 다른 4개 균주를 선발하고 16S rRNA 유전자 염기서열 결정을 통해 동정하였다. 그러나 종 수준까지 보다 정확하게 동정하기 위해서는 DNA-DNA hybridization이 필요하다.
- 5 ml) 2 ml에 혼합하여 상온에서 30분 반응시킨 다음 Infinite 200 PRO multimode reader (Tecan, Austria)를 이용하여 OD530을 측정하고, 표준 IAA (Sigma Aldrich, USA)를 사용하여 얻은 표준곡선을 이용하여 정량하였다. IAA 생성능과 nitrile 전환효소 활성을 비교하여 분리균주 SW5, SW9, SW13과 SW17를 선발하여 g-DNA를 추출하고 PCR을 수행한 후 (주)마크로젠에 의뢰하여 얻은 약 1,400 bp의 16S rRNA 유전자 염기서열을 EzTaxon server 2.1(Chun Lab., Korea)을 이용하여 NCBI 등록 균주들과 비교하여 동정하였다.
- IAN과 IAM을 이용한 IAA 생성능 조사를 위해 NB 배지에서 선배양한 근권세균을 OD600 1.0으로 보정하고 IAA 생성경로의 중간산물인 IAN과 IAM이 각각 3 mM 첨가된 NB 배지에 10%씩 접종하였다. 배양 중 24시간 간격으로 1 ml을 원심분리하여(3,010×g, 20 min) 상등액 0.
- 초본류 근권토양에서 21개 균주를 분리하여 [SW1~6: 강아지풀(Setaria viridis), SW7–10: 질경이(Plantago asiatica), SW11–21: 뚝새풀(Alopecurus aequalis)] IAA 생성능을 측정하였다. Nutrient broth (NB) 배지에서 배양(30℃)한 균주의 OD600을 1.0으로 보정하고 IAA의 전구물질인 L-tryptophan을 3 mM 첨가한 NB 배지에 10%씩 접종하였다. 배양 중 24시간 간격으로 1 ml을 원심분리하여(3,010×g, 20 min) 상등액 0.
- Tryptophan-비의존적 경로에 의한 IAA 생성을 조사하기 위해 NB 배지에서 선배양한 근권세균을 OD600 1.0으로 보정하고 추가 물질을 넣지 않은 NB 배지에 10% 접종하였다. 위의 IAA 측정방법과 동일하게 배양 중 24시간 주기로 IAA 양을 530 nm에서 측정하였다.
- , 2003). 균주의 단백질량 분석을 위해 위 실험의 원심분리를 통해 취한 침전물에 1 ml의 증류수를 혼합하고 Bradford 시약(Sigma Aldrich, USA)을 넣어 30분간 반응시킨 후 OD595를 측정하고, bovine serum albumin을 이용한 표준곡선으로 정량하였다.
- 대표적인 식물호르몬인 indole-acetic acid (IAA)를 생성하는 근권세균에서 IAA 생합성 경로와 생성량과의 관계를 파악하기 위해 IAA 생성능이 크게 다른 4개 균주를 선발하고 동정하였다. 특정 경로를 이용한 IAA 생합성능의 조사를 위해 주요 전구물질을 첨가하여 IAA 생성량을 측정하였다.
- 본 연구에서는 IAA 생성량이 다른 균주들을 선발하여 그들의 IAA 생성경로 중 nitrile 전환경로를 비교하여 각 균주의 IAA생성량과 nitrile 전환효소 활성 간에 상호연관성이 있는지 조사하였다. 또한 nitrilase 등에 의한 nitrile 전환능을 비교하여 cyanide 분해능 등으로 특화 가능성을 제시하였다.
- 배양 중 24시간 간격으로 1 ml을 원심분리하여(3,010×g, 20 min) 상등액 0.5 ml을 Salkowski 용액(H2SO4 150ml, H2O 250 ml, 1.5 M FeCl3·6H2O 7.5 ml) 2 ml에 혼합하여 상온에서 30분 반응시킨 후 위에서 설명한 IAA 측정방법과 동일하게 IAA를 측정하여 각각 nitrile hydratase와 amidase의 활성을 세포 단백질 무게비로 계산하였다.
- 분석은 HPLC(Waters, Breeze Model, USA)로 Luna 5μ C18(2) 250×4.60 mm column (Phenomenex, USA)을 이용하였고, flow rate는 0.8 ml/min, 파장은 254 nm, 이동상은 0.01 M phosphate buffer (pH 4.8)와 methanol을 65:35로 섞어서 사용하였다.
- 선발한 4균주의 배양 시 L-tryptophan, IAN과 IAM을 각각 첨가한 조건과 tryptophan 무첨가 조건에서 IAA 생합성량을 측정하였다. L-tryptophan 첨가 시 A.
- 8)와 methanol을 65:35로 섞어서 사용하였다. 시료 측정 시 mandelic acid를 standard로 사용하여 정량하였다(Banerjee et al., 2003). 균주의 단백질량 분석을 위해 위 실험의 원심분리를 통해 취한 침전물에 1 ml의 증류수를 혼합하고 Bradford 시약(Sigma Aldrich, USA)을 넣어 30분간 반응시킨 후 OD595를 측정하고, bovine serum albumin을 이용한 표준곡선으로 정량하였다.
- 초본류 근권토양에서 21개 균주를 분리하여 [SW1~6: 강아지풀(Setaria viridis), SW7–10: 질경이(Plantago asiatica), SW11–21: 뚝새풀(Alopecurus aequalis)] IAA 생성능을 측정하였다.
- , 2009). 특정 경로를 이용한 IAA 생합성 정도를조사하기 위해 주요 전구물질을 첨가하여 IAA 생성을 조사하였다. 세균의 IAA 생합성에 IAM을 통한 경로가 매우 중요하며(Sekine et al.
- 대표적인 식물호르몬인 indole-acetic acid (IAA)를 생성하는 근권세균에서 IAA 생합성 경로와 생성량과의 관계를 파악하기 위해 IAA 생성능이 크게 다른 4개 균주를 선발하고 동정하였다. 특정 경로를 이용한 IAA 생합성능의 조사를 위해 주요 전구물질을 첨가하여 IAA 생성량을 측정하였다. Tryptophan 의존적경로에 의한 총 IAA 생성량은 Acinetobacter guillouiae SW5가1.
- 회수한 ether를 증발시키고 5 ml의 methanol에 녹인 뒤 0.13 μm 공극의 여과막으로 여과하여 분석시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 4균주 중 A. guillouiae SW5만이 tryptophan을 첨가하지 않은 NB 배지에서 16–19 mg/L의 IAA를 생성하였다.
성능/효과
- B. thuringiensis SW17은 4균주 중 IAA 생합성량이 가장 낮았지만(Fig. 2), amidase 활성을 이용할 경우 5일째 3,727 μg/mg protein의 IAA를 생합성하여 전체 IAA 생성 양상과는 매우 상이함을 보였다(Fig. 4).
- 66 mg/ml로 가장 높았으며, indole acetamide (IAM)를 배지에 첨가했을 때 amidase의 활성은 분리균주 중 Rhodococcus equiSW9이 가장 높았다. IAA 생합성을 위한 또 다른 두 가지 경로의 전구물질인 indole acetonitrile (IAN)을 첨가하였을 때 IAA생합성은 A. guillouiae SW5가 가장 높았으며, 이 때 nitrilase 보다는 nitrile hydratase의 활성이 높았다. 그러나 두 경로 중 IAN을 직접 IAA로 전환시키는 nitrilase의 활성은 Bacillus thuringiensisSW17이 균주들 중 가장 높았다.
- L-tryptophan 첨가 시 A. guillouiae SW5가 배양 2일째에 농도로는 1.66 mg/ml, 단백질량 기준으로는 3,936 μg/mgprotein으로 가장 높은 생성능을 보였다(Fig. 2).
- Nitrile 전환효소 활성을 가진 균주들 중 IAA 생성능이 크게 다른 4균주를 선택하였는데 이들의 IAA 생성능은 SW5가 13,368 μmol/mg protein으로 월등하게 높고 SW13과 SW9가 각각 1,021과 1,004 μmol/mg protein, 그리고 SW17이 147 μmol/mg protein으로 가장 낮았으며 SW5, 9와 17은 그람 양성이고 SW13은 그람 음성이었다.
- 특정 경로를 이용한 IAA 생합성능의 조사를 위해 주요 전구물질을 첨가하여 IAA 생성량을 측정하였다. Tryptophan 의존적경로에 의한 총 IAA 생성량은 Acinetobacter guillouiae SW5가1.66 mg/ml로 가장 높았으며, indole acetamide (IAM)를 배지에 첨가했을 때 amidase의 활성은 분리균주 중 Rhodococcus equiSW9이 가장 높았다. IAA 생합성을 위한 또 다른 두 가지 경로의 전구물질인 indole acetonitrile (IAN)을 첨가하였을 때 IAA생합성은 A.
- 4). Tryptophan, IAN과 IAM을 첨가하지 않은 NB 배지에서의 IAA 생합성은 A. guillouiae SW5에서만 배양 1일째에 19 mg/L와 2일째에 16 mg/L의 낮은 수준으로 측정되었다.
- 각 균주들의 IAA 생합성 경로 활성을 종합하여 도식화하였는데 화살표의 굵기가 굵을수록 활성도가 높은 것이다. A.
- 균주 선발과 특성 파악을 위해 IAA 생성능을 단백질량 당 생성량으로 측정하였는데 21개 균주에서 13,368–147 μmol/mg protein으로 매우 넓은 범위를 나타내었다.
- guillouiae SW5가 가장 높았으며, 이 때 nitrilase 보다는 nitrile hydratase의 활성이 높았다. 그러나 두 경로 중 IAN을 직접 IAA로 전환시키는 nitrilase의 활성은 Bacillus thuringiensisSW17이 균주들 중 가장 높았다. B.
- 본 연구에서는 IAA 생성균주에서 IAA 생합성능과 생합성 경로와의 관계를 밝히고자 하였는데 분리균주 중 A. guillouiaeSW5는 IAA 생합성 경로 중 tryptophan-의존적 경로에 관여하는 여러 가지 효소들의 활성이 우수하며 또한 tryptophan-비의존적 경로를 통한 IAA 생합성까지도 확인되었다. 이 A.
- Nitrile 전환효소 활성을 가진 균주들 중 IAA 생성능이 크게 다른 4균주를 선택하였는데 이들의 IAA 생성능은 SW5가 13,368 μmol/mg protein으로 월등하게 높고 SW13과 SW9가 각각 1,021과 1,004 μmol/mg protein, 그리고 SW17이 147 μmol/mg protein으로 가장 낮았으며 SW5, 9와 17은 그람 양성이고 SW13은 그람 음성이었다. 선발한 균주들을 16S rRNA 유전자 염기서열로 동정한 결과 SW5는 Acinetobacter guillouiae ATCC 11171(T)와 97.875%,SW17은 Bacillus thuringiensis ATCC 10792(T)와 99.801%,SW9는 Rhodococcus equi DSM 20307(T)와 100%, SW13은 Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717(T)와 97.319%의 상동성을 보였다.
- 1). 이 두 경로의 공동 전구물질인 IAN을 첨가하였을 때 IAA 생합성은 A. guillouiae SW5가 가장 높았으며(Fig. 3), 총 IAA 생합성능도 가장 높았지만(Fig. 2), nitrilase 보다는 nitrile hydratase의 활성이 높은 것으로 추정된다(Fig. 5). 그러나 두 경로 중 IAN을 직접 IAA로 전환시키는 nitrilase의 활성은 B.
후속연구
- 7). 따라서 indole-3-pyruvate를 거치는 경로에 관여하는 효소들의 활성도를 측정한다면 보다 정확한 예측이 가능할 것이다.
- , 2010) SW5 균주는 IAA생합성능이 매우 높기 때문에 보다 많은 연구를 통해 식물생장촉진을 위한 미생물제로 개발될 가능성이 높다. 또한 nitrilase,amidase 등 nitrile converting enzyme의 활성이 높은 균주들을cyanide 제거 등의 특화된 용도에 효율적으로 이용하거나 유전자 형질전환에도 활용할 수 있을 것이다.
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