식물 병원성 곰팡이에 길항작용을 갖는 다양한 Bacillus sp.의 균주 분리와 특성에 관한 연구 Isolation and Characterization of Various Strains of Bacillus sp. having Antagonistic Effect Against Phytopathogenic Fungi원문보기
본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물 병원성 곰팡이에 대해서 길항작용을 나타내는 것을 확인하였으며, 또한 분리 균주의 경우 세균성 균주에 대해서도 길항작용을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 길항작용은 Bacillus 속이 생산하는 2차 대사산물인 siderophore, 항생물질, 세포 외 효소 활성 등에 의해서 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 나타내는 것으로 보이며, 특히 분리 균주로부터 생산되는 세포 외 효소는 식물 병원성 곰팡이의 세포벽에 용균작용 일으킴에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 생각된다. 또한 질소 고정능 및 IAA 생성능을 통해 식물 생장 촉진 및 식물 병원성 곰팡이 성장을 억제시킬 수 있는 생물학적 제제로서 식물재배에 도움을 줄 것으로 기대된다. 최종 선별된 Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, Bacillus methylotrophicus ANGa27를 이용하여 식물 병원성 곰팡이 방제 및 식물 생장촉진활성을 가지는 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물 병원성 곰팡이에 대해서 길항작용을 나타내는 것을 확인하였으며, 또한 분리 균주의 경우 세균성 균주에 대해서도 길항작용을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 길항작용은 Bacillus 속이 생산하는 2차 대사산물인 siderophore, 항생물질, 세포 외 효소 활성 등에 의해서 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 나타내는 것으로 보이며, 특히 분리 균주로부터 생산되는 세포 외 효소는 식물 병원성 곰팡이의 세포벽에 용균작용 일으킴에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 생각된다. 또한 질소 고정능 및 IAA 생성능을 통해 식물 생장 촉진 및 식물 병원성 곰팡이 성장을 억제시킬 수 있는 생물학적 제제로서 식물재배에 도움을 줄 것으로 기대된다. 최종 선별된 Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, Bacillus methylotrophicus ANGa27를 이용하여 식물 병원성 곰팡이 방제 및 식물 생장촉진활성을 가지는 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
This study was carried out to examine the antagonistic effect against phytopathogenic fungi of isolated strains from soil samples collected from Busan, Changwon, and Jeju Island: Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Corynespora cassiicola, Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici...
This study was carried out to examine the antagonistic effect against phytopathogenic fungi of isolated strains from soil samples collected from Busan, Changwon, and Jeju Island: Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Corynespora cassiicola, Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, and Sclerotinia sclerotiorum. According to results of our studies, isolated strains showed an antagonistic effect against phytopathogenic fungi. Such an antagonistic effect against phytopathogenic fungi is seen due to the production of siderophores, antibiotic substances, and extracellular amylase, cellulase, protease, and xylanase enzyme activities. Extracellular enzymes produced by isolated strains were significant, given that they inhibited the growth of phytopathogenic fungi by causing bacteriolysis of the cell wall of plant pathogenic fungi. This is essential to break down the cell wall of plant pathogenic fungi and thus help plant growth by converting macromolecules, which cannot be used by the plant for growth, into small molecules. In addition, they are putative candidates as biological agents to promote plant growth and inhibit growth of phytopathogenic fungi through nitrogen fixation, indole-3-acetic acid production, siderophore production, and extracellular enzyme activity. Therefore, this study suggests the possibility of using Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, and Bacillus methylotrophicus ANGa27 as new biological agents, and it is considered that further studies are necessary to prove their effect as novel biological agents by standardization of formulation and optimization of selected effective microorganisms, determination of their preservation period, and crop cultivation tests.
This study was carried out to examine the antagonistic effect against phytopathogenic fungi of isolated strains from soil samples collected from Busan, Changwon, and Jeju Island: Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Corynespora cassiicola, Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, and Sclerotinia sclerotiorum. According to results of our studies, isolated strains showed an antagonistic effect against phytopathogenic fungi. Such an antagonistic effect against phytopathogenic fungi is seen due to the production of siderophores, antibiotic substances, and extracellular amylase, cellulase, protease, and xylanase enzyme activities. Extracellular enzymes produced by isolated strains were significant, given that they inhibited the growth of phytopathogenic fungi by causing bacteriolysis of the cell wall of plant pathogenic fungi. This is essential to break down the cell wall of plant pathogenic fungi and thus help plant growth by converting macromolecules, which cannot be used by the plant for growth, into small molecules. In addition, they are putative candidates as biological agents to promote plant growth and inhibit growth of phytopathogenic fungi through nitrogen fixation, indole-3-acetic acid production, siderophore production, and extracellular enzyme activity. Therefore, this study suggests the possibility of using Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, and Bacillus methylotrophicus ANGa27 as new biological agents, and it is considered that further studies are necessary to prove their effect as novel biological agents by standardization of formulation and optimization of selected effective microorganisms, determination of their preservation period, and crop cultivation tests.
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문제 정의
식물 병원성 곰팡이에 대한 길항 능력 외에도 식물의 생장을 촉진하는 능력을 확인하기 위해서 질소 고정능과 IAA 생성능을 확인하였다. 대기 중의 질소는 공기 중에 가장 많이 존재하지만, 생물체가 이용할 수 없는 N2의 형태로 존재하여 이용성이 현저히 떨어지므로 질소 고정능을 가지는 균주를 분리하고자 하였다[29]. 먼저 분리 선별된 균주에 대하여 질소원이 결핍된 무기염과 탄소원만 들어 있는 선택배지인 NFB 배지에서 질소 고정화 실험을 하였으며, 질소 고정능은 푸른색으로 변화했거나 균주의 성장을 보고 양성 판정하였다.
Bacillus 속에서 분비되는 진균 외벽 가수분해효소는 식물 병원성 곰팡이의 세포벽을 분해하는 용균작용을 수행한다고 보고되고 있으며, 여러 종류의 세포외 효소들에 의한 식물 병원성 곰팡이 생장을 저해하는 방법이 널리 사용되고 있다[32]. 따라서, 본 실험에서는 최종 선별된 균주를 대상으로 amylase, cellulase, protease, xylanase 생성능을 조사하였다. 분리 균주 세포외로 효소를 분비하는 것으로 확인하였다 (Table 5).
따라서, 본 연구에서는 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양과 뿌리로부터 식물 병원성 곰팡이(잿빛 곰팡이를 유발하는 Botrytis cinerea KACC 40574, 탄저병을 유발하는 Colletotrichum acutatum KACC40801, 잎 마름병을 유발하는 Corynespora cassiicola KACC 44719, 시듦병을 유발하는 Fusarium sp. KACC 40241, 고추역병을 유발하는 Phytophthora capsici KACC 40180, 뿌리 썩음병을 유발하는 Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124, 균핵병을 유발하는 Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457)에 대해 길항능력을 갖는 미생물을 분리하고, 세포외 효소 생성능 및 생리학적 특성 분석을 통한 우수한 미생물을 선별하여 생물학적 방제제로써 사용이 가능한 새로운 미생물을 탐색하고자 하였다.
는 처음 미생물제제로써 이용이 되어왔으며, 특히 Bacillus 속 균주로부터 생성되는 circulin, colistin 및 polymyxin과 같은 항생물질은 그람 양성균 및 그람 음성균뿐만 아니라 식물 병원성 곰팡이에 대해서도 활성을 가지며, 항생물질 외에도 세포벽을 분해하는 효소, siderophore 등 식물 병원성 곰팡이의 증식을 최소화 또는 예방하기 위한 물질을 생성한다[18]. 따라서, 선별된 균주를 이용하여 식물 병원성 곰팡이의 생장 억제를 확인하고자 하였다.
subtilis YK-5 균주를 궁중무 및 벼를 대상으로 재배한 결과 무처리구에 비해 경엽수, 줄기 및 뿌리의 길이가 약 60% 이상 증가하는 결과를 나타내었으며, 이결과를 통해 분리 균주가 식물 생장에 도움을 줄 것으로 판단된다. 따라서, 식물 병원성 곰팡이의 생장억제 외에도 다양한 생물 검정을 통해 생물학적 방제제로서의 기능성을 추가로 확인하고자 하였다.
일반적으로 중성과 약산성 토양 조건에서 토착미생물의 생장이 유리하며, 외부에서 도입된 미생물도 중성과 약산성 조건에서 잘 정착하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 중성과 약산성 토양을 중심으로 미생물을 분리하고자 하였다[17]. 미생물의 분리는 부산 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 부산 대저 토마토 밭의 토양 및 토마토 뿌리, 부산 기장 배 밭의 토양 및 배나무 뿌리, 창원 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 창원 텃밭의 토양 및 고추 뿌리, 제주 공원의 토양 및 들풀 뿌리, 제주도 해안가 인근 해변의 토양 및 들풀 뿌리 등 7곳에서 이루어졌으며, 토양 및 근권 뿌리로부터 816종 미생물을 순수 분리하였다(Table 1).
가설 설정
1) Data are mean ± SD of at least three replicates.
1)Data are mean ± SD of at least three replicates.
2)ND : Not detected.
2) Nitrogen fixation ability determined by color change of NFB broth. - : no activity, + : activity, W : weakly activity.
2)ND : Not detected.
3) Absorbance was measured with a spectrophotometer at 530 nm. Significantly different at p < 0.
제안 방법
16S rRNA 유전자 구간을 증폭시키기 위해서 universal primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’)를 사용하여 PCR로 30 cycles (94.0℃-5분, 55.0℃-30초, 72.0℃-1분)을 실행하였다(TP600, Takara Bio Inc., Japan).
8)를 혼합한 뒤 고압 멸균하여, 50℃로 식힌 후 CAS 염료 용액과 혼합하여 CAS 평판 배지를 준비하였다. CAS 평판 배지에 접종하여 배양한후 orange halo zone 형성 유무를 관찰하였다.
1 unit은 상기의 시험조건 하에서 starch로부터 1 μg의 D-maltose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소량으로 나타내었다. Cellulase 활성은 Shin과 Cho의 방법[15]을 일부 변형하여 시험을 진행하였다. Carboxymethyl cellulose (CMC)를 함유한 nutrient broth에 균주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양 후 원심분리(3000rpm, 4℃, 10분) 하였다.
분리용 NFB 배지는 무기염과 탄소원만 들어 있고 질소원이 결핍된 배지로서 대기 중의 질소를 고정할 능력이 있는 균주만이 생장할 수 있는 선택배지이다[12]. NFB 배지에 전배양된 균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양하면서 배지 색이 파란색으로 색깔이 변할 경우 양성으로 판단하였다.
효소활성의 1 unit은 상기의 시험조건 하에서 1 μg의 tyrosine을 유리시키는 효소의 양을 환산하여 나타내었다. Xylanase의 활성은 Shin과 Cho의 방법[15]을 일부 변형하여 시험을 진행하였다. Beechwood xylan을 함유한 nutrient broth에 균주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양 후 원심분리(3000 rpm, 4℃, 10분) 하였다.
균주가 분비하는 효소의 특성 분석은 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 이용하여 분석하였으며, suspension medium (2 ml)에 분리 균주를 풀어 McFarland standard (Biomérieux, France)의 5 McFarland로 탁도를 맞춰 검체를 준비하였다.
균주가 분비하는 효소의 특성 분석은 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 이용하여 분석하였으며, suspension medium (2 ml)에 분리 균주를 풀어 McFarland standard (Biomérieux, France)의 5 McFarland로 탁도를 맞춰 검체를 준비하였다. 그 다음 각 큐플에 검체를 접종하여 37℃에서 4시간 배양 후 ZYM A와 ZYM B 시약을 한 방울씩 떨어뜨렸다. 5분 후 판독표에 따라 결과를 확인하였다.
또한 식물은 생식기간에 고온에 노출되면 작물의 생산량이 많이 감소한다[22]. 따라서, 분리 균주를 다양한 온도 조건에서 배양하여 24시간 간격으로 분리 균주의 성장을 확인하였다. 측정 결과, 5℃ 이하에서는 모든 균주가 성장하지 못하였으나, 10℃에서는 ANGa3, ANGa5, ANGa25의 성장을 확인할 수 있다.
0002% MnSO4), potato dextrose agar (PDA, DifcoTM), tryptic soygar (TSA, DifcoTM) plate에 도말하여 균을 분리하였다. 또한 뿌리 주변으로부터 근권 미생물의 분리를 위해 계면활성제인 Tween 80와 표백제인 perchloric acid (1%)를 처리하여 표면 미생물을 제거하였다. 그 후 BA, GMSA, PDA, TSA에 2일간 30℃에서 배양하여 순수분리하였다[10].
대기 중의 질소는 공기 중에 가장 많이 존재하지만, 생물체가 이용할 수 없는 N2의 형태로 존재하여 이용성이 현저히 떨어지므로 질소 고정능을 가지는 균주를 분리하고자 하였다[29]. 먼저 분리 선별된 균주에 대하여 질소원이 결핍된 무기염과 탄소원만 들어 있는 선택배지인 NFB 배지에서 질소 고정화 실험을 하였으며, 질소 고정능은 푸른색으로 변화했거나 균주의 성장을 보고 양성 판정하였다. Group 1의 ANGa3과 ANGa5을 비교하면, ANGa3은 10−55℃에서 모두 활성을 나타냈으며, ANGa5의 경우에는 10−50℃에서 활성을 나타내는 것을 확인하였다(Table 4).
모든 실험은 10−55℃에서 배양한 후 각 실험방식에 따라 식물 병원성 곰팡이 길항능 조사, 항균 활성, siderophoe 생성능, 질소고정능, IAA 생성능, 세포외 효소 활성능을 조사하였다.
분리 균주에서 세균에 대한 항균 활성을 알아보기 위해서 병원성 미생물 7종을 이용하여 시험을 진행하였으며, 그 결과를 Table 3에 나타내었다. B.
분리 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였으며, 균체를 TSB에 접종하여 30℃에서 2일간 배양후 균체를 회수하였다. 회수한 균체의 DNA는 Wizard® Genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 추출하였다.
분리 균주의 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 조사를 위해서 식물 병원성 곰팡이 7종을 이용하여 시험을 진행 하였다. 생장 저해 활성은 PDA 배지에 대치배양법을 통해 생육 저지대를 측정하여 활성 여부를 판단하였다.
분리된 균주들의 온도에 따른 생장 조건을 확인하기 위해, 30 ml의 TSB 배지에 균주 0.5%를 접종하여 0−60℃에서 8일간 진탕 배양하여 24시간 간격으로 분광광도계 (Spectrophotometer, Multiskan GO, Thermo Scientific, Finland)를 이용하여 600 nm에서 측정하였다.
분리 균주의 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 조사를 위해서 식물 병원성 곰팡이 7종을 이용하여 시험을 진행 하였다. 생장 저해 활성은 PDA 배지에 대치배양법을 통해 생육 저지대를 측정하여 활성 여부를 판단하였다. 연구 결과는 Table 2에 나타내었다.
선별한 6 균주를 생육 가능 온도 범위에 따라서 다음과 같이 group 1은 10−55℃, group 2는 15−55℃, group 3은 10−50℃로 생육온도 범위에 따라 3 group으로 구별하여 분류하였으며, 모든 실험은 1 × 106 CFU/ml 접종하여 10−55℃에서 배양 후 시험을 진행하였다.
식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용은 PDA를 이용한 well diffusion 법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 균주를 접종하여 검정 균주와 25℃에서 대치 배양하였다. 식물 병원성 곰팡이과 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다.
식물 병원성 곰팡이에 대한 길항 능력 외에도 식물의 생장을 촉진하는 능력을 확인하기 위해서 질소 고정능과 IAA 생성능을 확인하였다. 대기 중의 질소는 공기 중에 가장 많이 존재하지만, 생물체가 이용할 수 없는 N2의 형태로 존재하여 이용성이 현저히 떨어지므로 질소 고정능을 가지는 균주를 분리하고자 하였다[29].
식물성 호르몬인 IAA 생산능을 평가하기 위해 0.1%의 Ltryptophane을 첨가한 King’s B (2% proteose peptone, 0.25% K2HPO4, 0.6% MgSO4, 1.5% glycerol) 배지에 분리된 균을 접종하여 30℃에서 2일간 배양한 후 배양액을 4℃에서 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
정제된 PCR 산물은 1% agarose gel을 이용하여 확인하였다. 염기서열 분석은 Solgent Co., Ltd. (Korea)에 의뢰하였으며, 염기서열은 NCBI의 BLASTN을 통해 등록된 균주와 상동성을 비교하였다.
유용미생물에 의해 생산되는 철(Fe) 성분과 결합 물질인 siderophore의 생산 여부를 확인하기 위해서 chrome azurole S (CAS) blue agar plate assay 이용하여 시험하였다[11]. 50 ml 증류수에 CAS 60 mg을 녹이고, 10 mM HCl 용액 10 ml에 2.
결과적으로 분리 균주가 생성하는 amylase, cellulase, protease, xylanase에 의해서 식물 병원성 곰팡이 세포벽의 용균작용이 일어남에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 보이며, 또한 이용할 수 없는 고분자의 물질을 저분자의 물질로 변화시켜 식물이 이용할 수 있도록 하여 생장하는데 도움을 줄 것으로 생각된다. 이 외에도 균주가 갖는 효소적 특성을 확인하기 위해서 API ZYM kit를 이용하여 측정하였으며, ANGa5, ANGa25, ANGa27의 효소적 특성을 확인한 결과를 Table 5에 나타냈다. 공통적으로 alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase의 효소반응에 대해서 양성반응을 보였다.
3412, NucleoGen, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 1% agarose gel을 이용하여 확인하였다. 염기서열 분석은 Solgent Co.
따라서, 각 group에서 최종 ANGa5, ANGa25, ANGa27를 선정하였다. 최종 선정된 균주를 혼합 배양하여 IAA 생성능에 대한 시너지 효과를 확인하고자 하였으며, 그결과는 Fig. 2에 나타내었다. 시너지 효과를 확인 결과, group 1의 ANGa5와 group 2의 ANGa27를 혼합 배양한 경우 약 1.
발색되는 정도는 분광광도계를 이용하여 530 nm에서 측정하였다. 표준물질로 IAA를 이용하여, 위와 같은 동일한 방법으로 실험한 후 검량선을 작성하여 시료의 농도를 환산하였다[13].
)와 가스팩을 이용하여 혐기적 조건하에서 배양하였다. 항균활성은 균체 주위에 형성된 생육 저지대(clear zone)의 확인 유무에 따라 양성, 음성 판단하였다.
회수한 균체의 DNA는 Wizard® Genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 추출하였다.
대상 데이터
미생물의 분리는 부산 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 부산 대저 토마토 밭의 토양 및 토마토 뿌리, 부산 기장 배 밭의 토양 및 배나무 뿌리, 창원 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 창원 텃밭의 토양 및 고추 뿌리, 제주 공원의 토양 및 들풀 뿌리, 제주도 해안가 인근 해변의 토양 및 들풀 뿌리 등 7곳에서 이루어졌으며, 토양 및 근권 뿌리로부터 816종 미생물을 순수 분리하였다(Table 1). 1차적으로 7종의 식물 병원성 곰팡이에 모두 길항능을 가지는 26종 균주를 선발하였으며, 최종적으로 활성이 높은 6균주를 선발하였다.
분리한 균주들의 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 조사하기 위하여 Botrytis cinerea KACC 40574, Colletotrichum acutatum KACC40801, Corynespora cassiicola KACC 44719, Fusarium sp. KACC 40241, Phytophthora capsici KACC 40180, Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124, Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457 등으로 총 7 균주를 대상으로 검정하였다. 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용은 PDA를 이용한 well diffusion 법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 균주를 접종하여 검정 균주와 25℃에서 대치 배양하였다.
분리한 균주들의 세균성 미생물에 대한 항균 활성을 조사하기 위해서 Bacillus cereus KCCM 11204, Staphylococcus aureus subsp. aureus KCCM 11335, Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965, Listeria monocytogenes KCCM 43155, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894, Clostridium perfringens ATCC 13124, Yersinia enterocolitica ATCC 23715 등으로 총 7 균주를 대상으로 검정하였다. 병원성 미생물에 대한 항균 활성은 TSA를 이용한 well diffusion 법을 이용하였으며, B.
다양한 환경에서 우수한 균주를 탐색을 위하여 부산, 창원, 제주도 일대의 토양을 채취하여 미생물을 분리하였다. 채취한 토양 시료는 증류수 9 ml에 각 토양 1 g을 멸균된 생리 식염수에 현탁 후 Bennet agar (BA, 1% glucose, 0.
Group 3인 ANGa27의 경우에는 균주 성장범위인 10−50℃에서 IAA 생성능을 확인할 수 있었다. 따라서, Group 1에서는 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용이 우세했던 ANGa5을 선정하였으며, Group 2에서는 ANGa7과 ANGa27이 병원성 곰팡이에 대한 길항작용, siderphore 생성능 및 질소고정능의 활성이 비슷했지만 ANGa27이 IAA 생성능이 높았기 때문에 group 2에서는 최종 ANGa27를 선정하였다. 따라서, 각 group에서 최종 ANGa5, ANGa25, ANGa27를 선정하였다.
따라서, Group 1에서는 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용이 우세했던 ANGa5을 선정하였으며, Group 2에서는 ANGa7과 ANGa27이 병원성 곰팡이에 대한 길항작용, siderphore 생성능 및 질소고정능의 활성이 비슷했지만 ANGa27이 IAA 생성능이 높았기 때문에 group 2에서는 최종 ANGa27를 선정하였다. 따라서, 각 group에서 최종 ANGa5, ANGa25, ANGa27를 선정하였다. 최종 선정된 균주를 혼합 배양하여 IAA 생성능에 대한 시너지 효과를 확인하고자 하였으며, 그결과는 Fig.
따라서, 중성과 약산성 토양을 중심으로 미생물을 분리하고자 하였다[17]. 미생물의 분리는 부산 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 부산 대저 토마토 밭의 토양 및 토마토 뿌리, 부산 기장 배 밭의 토양 및 배나무 뿌리, 창원 야산의 토양 및 들풀 뿌리, 창원 텃밭의 토양 및 고추 뿌리, 제주 공원의 토양 및 들풀 뿌리, 제주도 해안가 인근 해변의 토양 및 들풀 뿌리 등 7곳에서 이루어졌으며, 토양 및 근권 뿌리로부터 816종 미생물을 순수 분리하였다(Table 1). 1차적으로 7종의 식물 병원성 곰팡이에 모두 길항능을 가지는 26종 균주를 선발하였으며, 최종적으로 활성이 높은 6균주를 선발하였다.
질소 고정세균 분리용 nitrogen free bromothymol blue (NFB, 0.5% (HOOCCH2CH(OH)COOH, 0.05% K2HPO4, 0.001% MgSO4·7H2O, 0.002% NaCl, 0.005% FeSO4·7H2O, 0.0002% Na2MoO4, 0.001% MnSO4· 7H2O, 0.001% CaCl2, 0.4% KOH, 0.2% bromothymol blue (in 0.5% alcohol), 0.175% agar, pH 6.8) 배지를 이용하였다.
데이터처리
모든 분석은 3회 이상 수행하였으며, 평균±표준편차(Mean ± SD)로 표현하였다.
평균값의 유의한 차이는 SPSS(version 20.0 for Windows, SPSS Inc., USA)를 이용한 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)의 Duncan’s multiple comparisons를 사용하였다.
이론/모형
aureus KCCM 11335, Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965, Listeria monocytogenes KCCM 43155, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894, Clostridium perfringens ATCC 13124, Yersinia enterocolitica ATCC 23715 등으로 총 7 균주를 대상으로 검정하였다. 병원성 미생물에 대한 항균 활성은 TSA를 이용한 well diffusion 법을 이용하였으며, B. cereus는 30℃에서, 그 외 나머지 병원성 미생물은 37℃에서 각각 배양하였다. C.
KACC 40241, Phytophthora capsici KACC 40180, Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124, Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457 등으로 총 7 균주를 대상으로 검정하였다. 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용은 PDA를 이용한 well diffusion 법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 균주를 접종하여 검정 균주와 25℃에서 대치 배양하였다. 식물 병원성 곰팡이과 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다.
성능/효과
2차 선별된 26가지 균주의 16S rRNA 유전자염기서열을 BLASTN에서 분석한 결과 Bacillus subtilis 8종, Bacillus velezensis 7종, Bacillus tequilensis 6종, Bacillus methylotrophicus 3종, Bacillus megaterium 1종, Bacillus aerius 1종으로 판명되었으며, 26종 모두 Bacillus sp.로 확인이 되었다.
분리 균주에서 세균에 대한 항균 활성을 알아보기 위해서 병원성 미생물 7종을 이용하여 시험을 진행하였으며, 그 결과를 Table 3에 나타내었다. B. cereus에 대해서 ANGa3을 제외한 모든 분리 균주에서 항균활성을 나타내었으며, S. aureus에 대해서는 ANGa3, ANGa5, ANGa22 균주에서 항균활성을 나타내었다. 또한 ANGa22 균주는 V.
로 확인이 되었다. B. subtilis 8종, B. velezensis 7종, B. tequilensis 6종, B. methylotrophicus 3종, B. megaterium 1종, B. aerius 1종에서 species마다 활성이 높은 균주 1종씩 최종 선별하였다. 최종 선별된 균주는 Bacillus megaterium ANGa3, Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus velezensis ANGa7, Bacillus tequilensis ANGa22, Bacillus aerius ANGa25, Bacillus methylotrophicus ANGa27로 명명하였다.
Group 1의 ANGa3과 ANGa5을 비교하면, ANGa3은 10−55℃에서 모두 활성을 나타냈으며, ANGa5의 경우에는 10−50℃에서 활성을 나타내는 것을 확인하였다(Table 4).
Group 2의 ANGa7, ANGa22, ANGa27의 경우에는 10℃에서 성장을 하지 않았기 때문에 10℃를 제외한 20−55℃의 범위에서 IAA 생성능을 확인하였으며, 3 균주 중에서는 ANGa22가 가장 높은 활성을 보였다.
59 U/ml로 나타났으며, 식물 병원성 곰팡이의 세포벽이 주로 cellulose로 구성되어 있어 용균작용이 일어날 것으로 생각된다[33]. 결과적으로 분리 균주가 생성하는 amylase, cellulase, protease, xylanase에 의해서 식물 병원성 곰팡이 세포벽의 용균작용이 일어남에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 보이며, 또한 이용할 수 없는 고분자의 물질을 저분자의 물질로 변화시켜 식물이 이용할 수 있도록 하여 생장하는데 도움을 줄 것으로 생각된다. 이 외에도 균주가 갖는 효소적 특성을 확인하기 위해서 API ZYM kit를 이용하여 측정하였으며, ANGa5, ANGa25, ANGa27의 효소적 특성을 확인한 결과를 Table 5에 나타냈다.
균주들이 공통적으로 alkaline phosphatase, esterase (C14), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, α-glucosidase 및 β-glucosidase 활성을 가지는 것을 확인하였다.
또한 10−55℃에서 IAA 생성능을 확인한 결과, Group 1의 ANGa3과 ANGa5의 경우에는 10−55℃의 범위에서 IAA 생성능을 나타냈으며, ANGa3보다는 ANGa5가 IAA 생성능이 높았다(Table 4).
측정 결과, 5℃ 이하에서는 모든 균주가 성장하지 못하였으나, 10℃에서는 ANGa3, ANGa5, ANGa25의 성장을 확인할 수 있다. 또한 15℃ 이상 50℃ 이하에서는 모두 성장을 확인할 수 있었으며, 55℃에서는 ANGa25를 제외한 ANGa3, ANGa5, ANGa7, ANGa22, ANGa27에서 성장을 확인할 수 있었다. 그러나, 60℃ 이상의 온도에서는 6개의 균주 모두 성장을 확인할 수 없었다(Fig.
aureus에 대해서는 ANGa3, ANGa5, ANGa22 균주에서 항균활성을 나타내었다. 또한 ANGa22 균주는 V. parahaemolyticus에 대해서도 항균 활성을 나타내었으며, 그 외에도 ANGa7, ANGa25, ANGa27에서 Y. enterocolitica에 대해서 항균 활성을 나타내었다. 시험 결과, 항균 활성이 크게 두드러지지는 않았지만 6가지 균주에서 모두 항균 물질을 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 Yun과 Cheng [31]의 연구에 의하면, Pantoae sp.를 108pfu/ml의 농도를 맞춰 100 ml를 접종하였을 때 어린 상추 식물 재배 시 생체량(fresh weight) 및 상층부 길이생장(shoot length)이 증가하는 결과를 보여주었다. 따라서, 분리 균주가 식물생장 호르몬인 IAA를 생성함으로써 뿌리 생장 강화 및 영양섭취를 용이하게 하여 식물 생장을 촉진할 것으로 기대된다.
연구 결과는 Table 2에 나타내었다. 먼저, group1의 ANGa3과 ANGa5를 비교했을 때, ANGa5가 P. capsici를 제외한 식물병원성 곰팡이에 대한 억제율이 ANGa3보다 우세한 것으로 확인하였다. 또한 ANGa3의 경우에는 B.
본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물 병원성 곰팡이에 대해서 길항작용을 나타내는 것을 확인하였으며, 또한 분리 균주의 경우 세균성 균주에 대해서도 길항작용을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 길항작용은 Bacillus 속이 생산하는 2차 대사산물인 siderophore, 항생물질, 세포 외 효소 활성 등에 의해서 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 나타내는 것으로 보이며, 특히 분리 균주로부터 생산되는 세포 외 효소는 식물 병원성 곰팡이의 세포벽에 용균작용 일으킴에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 생각된다.
2에 나타내었다. 시너지 효과를 확인 결과, group 1의 ANGa5와 group 2의 ANGa27를 혼합 배양한 경우 약 1.68배의 시너지 효과를 확인할 수 있었으며, group 2의 ANGa27과 group 3의 ANGa25를 혼합배양 한 경우에는 약2.40배의 시너지 효과를 확인할 수 있었다. IAA 생성능에 관한 Jung 등[30]의 연구에 의하면 IAA를 생산하는 B.
시험 결과, Table 4와 같이 siderophore활성을 나타냈으며, 대부분 10℃, 55℃를 제외한 20−50℃에서 siderophore 생성능을 확인할 수 있었으며, ANGa22의 경우에는 55℃에서도 siderophore 생성능을 확인할 수 있었다.
enterocolitica에 대해서 항균 활성을 나타내었다. 시험 결과, 항균 활성이 크게 두드러지지는 않았지만 6가지 균주에서 모두 항균 물질을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. Kindoli 등[24]의 연구에 의하면 청국장에서 분리한 B.
Group 3의 경우, ANGa25가 Fusarium sp.와 P. capsici를 제외한 나머지 식물 병원성 곰팡이에 대해 50% 이상의 높은 억제율을 보였으며, 그 중에서도 C. cassiicola에 대해서 80.6% 높은 억제율을 보였다. 또한 대부분 20−30℃에서 억제율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 분리 균주를 다양한 온도 조건에서 배양하여 24시간 간격으로 분리 균주의 성장을 확인하였다. 측정 결과, 5℃ 이하에서는 모든 균주가 성장하지 못하였으나, 10℃에서는 ANGa3, ANGa5, ANGa25의 성장을 확인할 수 있다. 또한 15℃ 이상 50℃ 이하에서는 모두 성장을 확인할 수 있었으며, 55℃에서는 ANGa25를 제외한 ANGa3, ANGa5, ANGa7, ANGa22, ANGa27에서 성장을 확인할 수 있었다.
후속연구
그 외 효소인 galactosidase, glucosidase, glucuronidase 등은 carbohydrate의 형성을 저해시키며, 또한 에너지 섭취에 부정적인 영향을 준다[36]. 따라서, 3가지 균주 모두 식물 병원성 곰팡이에 대한 진균 외벽 가수분해 효소를 지닌 균주로 식물 병원성 곰팡이의 성장을 저해하여 방제 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
를 108pfu/ml의 농도를 맞춰 100 ml를 접종하였을 때 어린 상추 식물 재배 시 생체량(fresh weight) 및 상층부 길이생장(shoot length)이 증가하는 결과를 보여주었다. 따라서, 분리 균주가 식물생장 호르몬인 IAA를 생성함으로써 뿌리 생장 강화 및 영양섭취를 용이하게 하여 식물 생장을 촉진할 것으로 기대된다.
이러한 길항작용은 Bacillus 속이 생산하는 2차 대사산물인 siderophore, 항생물질, 세포 외 효소 활성 등에 의해서 식물 병원성 곰팡이에 대한 길항작용을 나타내는 것으로 보이며, 특히 분리 균주로부터 생산되는 세포 외 효소는 식물 병원성 곰팡이의 세포벽에 용균작용 일으킴에 따라 세포벽을 분해하여 식물 병원성 곰팡이의 생장을 저해할 것으로 생각된다. 또한 질소 고정능 및 IAA 생성능을 통해 식물 생장 촉진 및 식물 병원성 곰팡이 성장을 억제시킬 수 있는 생물학적 제제로서 식물재배에 도움을 줄 것으로 기대된다. 최종 선별된 Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, Bacillus methylotrophicus ANGa27를 이용하여 식물 병원성 곰팡이 방제 및 식물 생장촉진활성을 가지는 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
이는 15−55℃ 구간 내에서 식물 재배 시 저온, 고온과 같은 비생물적 스트레스에도 내성을 부여하여 식물의 생장을 촉진하는 역할을 할 수 있을 것으로기대된다.
또한 질소 고정능 및 IAA 생성능을 통해 식물 생장 촉진 및 식물 병원성 곰팡이 성장을 억제시킬 수 있는 생물학적 제제로서 식물재배에 도움을 줄 것으로 기대된다. 최종 선별된 Bacillus subtilis ANGa5, Bacillus aerius ANGa25, Bacillus methylotrophicus ANGa27를 이용하여 식물 병원성 곰팡이 방제 및 식물 생장촉진활성을 가지는 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
근권 미생물의 특징은 무엇인가?
근권에는 수많은 종류의 미생물이 서식하고 있으며, 세균과 식물 병원성 곰팡이에 효과가 있는 biocontrol agent (BCA)로서 잠재적으로 효과가 있는 미생물이 존재한다. 이 근권 미생물들은 식물 병원성 곰팡이에 저항성을 유도하여 병원성 미생물의 침입 및 이상 기온과 같은 환경 스트레스에 대해 식물이 견딜 수 있도록 유도 전신 내성(ISR, induced systemic resistance)을 일으켜 병원성 미생물로부터 식물을 보호하는 중요한 역할을 한다[3]. 이 유도 전신 내성은 식물의 생장에 대한 약해 없이 면역반응을 유도하기 때문에 농업에 지속 가능한 농법으로 새롭게 조명되고 있다[4].
본 연구에서 미생물을 분리하는 기준으로 중성과 약산성 토양으로 나눈 이유는 무엇인가?
일반적으로 중성과 약산성 토양 조건에서 토착미생물의 생장이 유리하며, 외부에서 도입된 미생물도 중성과 약산성 조건에서 잘 정착하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 중성과 약산성 토양을 중심으로 미생물을 분리하고자 하였다[17].
근권 미생물의 유도 전신 내성을 일으키는 반응이 지속 가능한 농법으로 새롭게 조명되는 이유는 무엇인가?
이 근권 미생물들은 식물 병원성 곰팡이에 저항성을 유도하여 병원성 미생물의 침입 및 이상 기온과 같은 환경 스트레스에 대해 식물이 견딜 수 있도록 유도 전신 내성(ISR, induced systemic resistance)을 일으켜 병원성 미생물로부터 식물을 보호하는 중요한 역할을 한다[3]. 이 유도 전신 내성은 식물의 생장에 대한 약해 없이 면역반응을 유도하기 때문에 농업에 지속 가능한 농법으로 새롭게 조명되고 있다[4]. 특히 근권 미생물은 항진균 활성 및 세포벽 분해 효소를 생산하는 균주가 다수 존재하며, 영양요구성이 단순하여 glucose, 무기염, 아미노산만을 요구하며, 활발한 물질대사를 수행하는 것으로 알려져 있다[5].
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