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문제 정의
- 황사 먼지는 bioaerosol을 포함하며 미생물의 운반체로 작용할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 황사 발생 기간과 황사가 없는 기간 동안 각각 포집한 낙하먼지에서 미생물의 농도와 종 조성을 비교하고자 하였다. 2008년 2월부터 4월까지 울산 지역의 한 지점에서 직경 200 mm의 강수량계를 사용하여 낙하먼지를 포집하였으며, 조사 기간 동안 울산 지역에서 황사 현상은 3월 2일과 3일에 걸쳐 한번 발생하였다.
- 특히 수도권이나 서해안 지방에 비해 황사 발생 빈도와 강도가 상대적으로 낮은 울산 지역에서 황사 먼지의 미생물 분포에 대한 연구는 매우 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 황사가 주로 발생하는 2월에서 4월까지 낙하먼지의 포집 및 미생물학적 분석을 통해, 울산 지역에서 낙하먼지에 존재하는 미생물의 분포 및 종류, 그리고 황사 발생이 미생물 분포에 미치는 영향에 대한 기본 정보를 제공하고자 하였다.
- , 2009). 이들 연구에서는 황사 먼지가 사람 보건에 미치는 영향과 함께 새로운 미생물 유입에 의한 생태계 교란의 가능성에 대해 언급하고 있다. 미생물은 그 자체로 또는 미세먼지나 수증기와 결합한 형태로 bioaerosol을 형성하여 대기에 유입된다.
제안 방법
- 증폭한 PCR 산물은 PCR purification kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 정제하였다. 16S rRNA 유전자 절편의 서열 분석은 자동화된 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, 27F와 1492R을 이용하여 양쪽 방향에서 염기 서열을 분석하였다. 각각의 분리 세균으로부터 얻은 16S rDNA 부분 염기서열은 BioEdit version 7.
- 5℃에서 1분간 primer annealing, 72℃에서 1분간 extension을 총 34회 반복하고, 72℃에서 10분간 최종 반응시켰다. PCR 산물을 1% (w/v) agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액에서 염색하여 1.5 kb 정도 크기의 DNA 밴드를 확인하였다.
- 1). 낙하먼지 포집 지점과 인접한 울산시 효문동의 자동측정망에서 시간대별로 측정한 공기중 미세먼지의 농도를, 낙하먼지의 포집 시간 간격과 맞추어 84시간 동안의 평균값을 구하였다(Fig. 2). 84시간 평균 미세먼지 농도의 최소값은 4월 1일의 26.
- 낙하먼지에 포함된 미생물에 대한 정보를 얻기 위해, 본 연구에서는 배지에 시료를 접종한 후 생겨난 집락을 대상으로, 세균 집락은 16S rRNA 유전자 서열분석에 기초한 분자적 동정 시험을, 진균 집락은 형태적 특징에 기초한 잠정적 동정 시험을 행하였다. 환경 시료에 존재하는 미생물의 일부만이 배양될 수 있다는 것은 널리 알려져 있다(Pace, 1997).
- 낙하먼지에 포함된 배양이 가능한 세균수와 진균수는 각각 plate count agar와 dichloran rose bengal chloramphenicol(DRBC) agar를 사용하여 측정하였다(Atlas and Parks, 1996). 시료의 미생물 수 측정을 위한 접종은 채수 후 12시간 이내에 실험실에서 행하였으며, 도말평판법과 함께 막여과법도 병행하여 매 시료당 2개 농도에서 각각 duplicate로 접종하였다(American public health association, 1996).
- 낙하먼지에 포함된 세균의 순수배양 및 잠정적 동정 실험은 2월 22일에서 4월 22일까지 2개월간 포집한 시료를 대상으로 진행하였다. 매 시료마다 세균수 측정시 접종한 plate 중 임의의 1 개 plate를 선정하고, 여기서 생겨난 집락 중 최대 15개의 임의의 집락을 새로운 plate count agar에 접종하여 최초 분리하였으며, 생겨난 집락을 동일 배지에 계대 배양하여 순수배양을 얻었다.
- 2월 22일에서 4월 22일까지 포집한 낙하먼지로부터 검출된 진균을 대상으로 순수배양 및 동정 실험을 진행하였다. 세균과 같은 방식으로 임의의 집락을 선정하였으며, 매 시료마다 임의의 15개 집락을 DRBC agar에 일차 접종한 후, 생겨난 집락을 동일배지에 계대 배양하여 순수배양을 얻었다. 진균 분리 균주는, 집락의 색과 모양 등 형태적 특징과 lactophenicol cotton blue로 염색 후 현미경으로 관찰한 포자낭의 형태적 특징에 기초하여속 수준까지 잠정적으로 동정하였다(Watanabe, 1994; Samson et al.
- 낙하먼지에 포함된 배양이 가능한 세균수와 진균수는 각각 plate count agar와 dichloran rose bengal chloramphenicol(DRBC) agar를 사용하여 측정하였다(Atlas and Parks, 1996). 시료의 미생물 수 측정을 위한 접종은 채수 후 12시간 이내에 실험실에서 행하였으며, 도말평판법과 함께 막여과법도 병행하여 매 시료당 2개 농도에서 각각 duplicate로 접종하였다(American public health association, 1996). Plate count agar는 35℃에서 48시간 배양 후 생겨난 집락을 계수하였고, DRBC agar는 25℃에서 120시간 배양 후 나타난 집락을 계수하였다.
- 조사기간 중 강수량계를 사용하여 84시간 간격으로 주 2회 포집한 낙하먼지의 양을 그래프로 나타내었다(Fig. 1). 18회에 걸쳐 포집한 낙하먼지의 양은, 4월 15일 최소값인 1.
- 증폭한 PCR 산물은 PCR purification kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 정제하였다. 16S rRNA 유전자 절편의 서열 분석은 자동화된 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, 27F와 1492R을 이용하여 양쪽 방향에서 염기 서열을 분석하였다.
- 추출한 DNA로부터 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 27F (5ʹ-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3ʹ)와 1492R (5ʹ-GGT TAC CTT GTT ACGA CTT-3ʹ) universal primer set를 사용하여 thermocycler (MJ Research, USA)로 PCR을 수행하였다(Lane, 1991). PCR 조건은 PCR buffer (50 mM Tris-HCl, 250 mM KCl) 6 μl, dNTP mixture(2.
- 2ʹʹE)에 2개의 강수량계를 설치하였으며, 하나는 낙하먼지의 정량에, 다른 하나는 미생물 분석에 사용하였다. 포집기간 동안 매주 2회(화요일 오전 7시와 금요일 저녁 7시)씩, 강수량계의 용기에 84시간 동안 낙하한 먼지를 멸균한 증류수 200 ml로현탁한 후 멸균한 유리 용기에 옮겨 담았으며, 비가 왔을 경우 전체 빗물의 부피를 측정하고 빗물을 채수하였다.
- 포집한 낙하먼지로부터 최종적으로 87개 세균 집락의 순수배양을 얻었으며, 이중 45개 분리 세균의 16S rRNA 유전자 부분 염기서열을 대상으로 NCBI GenBank 데이터베이스의 등록된 서열과 비교하여 closest match를 조사하였다(Table 1). 16S rRNA 유전자 서열을 비교한 결과, 45개 분리 세균의 경우 Bacillus 속이 39개(87%), Staphylococcus 속이 6개(13%)였으며, 다른 속은 확인되지 않았다.
대상 데이터
- 따라서 본 연구에서는 황사 발생 기간과 황사가 없는 기간 동안 각각 포집한 낙하먼지에서 미생물의 농도와 종 조성을 비교하고자 하였다. 2008년 2월부터 4월까지 울산 지역의 한 지점에서 직경 200 mm의 강수량계를 사용하여 낙하먼지를 포집하였으며, 조사 기간 동안 울산 지역에서 황사 현상은 3월 2일과 3일에 걸쳐 한번 발생하였다. 낙하먼지에 포함된 세균의 농도는, 황사 기간 동안 포집한 시료에서 황사가 없는 기간의 시료에 비해 크게 높았다.
- 2월 22일에서 4월 22일까지 포집한 낙하먼지로부터 검출된 진균을 대상으로 순수배양 및 동정 실험을 진행하였다. 세균과 같은 방식으로 임의의 집락을 선정하였으며, 매 시료마다 임의의 15개 집락을 DRBC agar에 일차 접종한 후, 생겨난 집락을 동일배지에 계대 배양하여 순수배양을 얻었다.
- 낙하먼지를 포집하여 진균수를 측정한 DRBC agar에 생겨난 집락을 대상으로, 임의의 집락을 동일배지에 연속으로 계대 배양하여 최종적으로 152개의 순수배양을 얻었다(Table 2). 이중 형태적 특징에 기초하여 전체의 70%인 107개 집락을 잠정적으로 동정하였으며, 나머지 45개 집락은 형태적 특징만으로는 확인하기 어려웠다.
- 낙하먼지에 포함된 세균의 순수배양 및 잠정적 동정 실험은 2월 22일에서 4월 22일까지 2개월간 포집한 시료를 대상으로 진행하였다. 매 시료마다 세균수 측정시 접종한 plate 중 임의의 1 개 plate를 선정하고, 여기서 생겨난 집락 중 최대 15개의 임의의 집락을 새로운 plate count agar에 접종하여 최초 분리하였으며, 생겨난 집락을 동일 배지에 계대 배양하여 순수배양을 얻었다.
- 울산광역시 소재의 도로 교통량의 영향을 적게 받고 주위에 고층 빌딩이 없는 주택가 3층 건물의 옥상(위도 35° 31ʹ 21.5ʹʹN, 경도 129° 23ʹ 58.2ʹʹE)에 2개의 강수량계를 설치하였으며, 하나는 낙하먼지의 정량에, 다른 하나는 미생물 분석에 사용하였다.
- 황사가 주로 발생하는 봄철 낙하먼지에 포함된 미생물의 분포와 종류를 비교하기 위해, 2008년 2월부터 4월까지 직경 200mm의 강수량계를 이용하여 낙하먼지를 포집하였다. 울산광역시 소재의 도로 교통량의 영향을 적게 받고 주위에 고층 빌딩이 없는 주택가 3층 건물의 옥상(위도 35° 31ʹ 21.
데이터처리
- 16S rRNA 유전자 절편의 서열 분석은 자동화된 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, 27F와 1492R을 이용하여 양쪽 방향에서 염기 서열을 분석하였다. 각각의 분리 세균으로부터 얻은 16S rDNA 부분 염기서열은 BioEdit version 7.0.5.3의 contig assembly program을 사용하여 배열하였으며, Basic Local Alignment Search Tool을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank에 등록된 서열과 비교하였다 (Hall, 1999). 본 연구에서 분리한 세균의 염기 서열은 GenBank에 제출되었으며, accession number JX094893-JX094937으로 등록되었다.
이론/모형
- 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자적 세균 동정을 위해 분리한 세균을 Luria-Bertani broth (Atlas and Parks, 1996)에 접종하였으며, 배양한 세포로부터의 genomic DNA 추출에는 DNeasyⓇ blood & tissue kit (QIAGEN, USA)을 사용하였다.
- 낙하먼지의 정량은 표준시험법의 총 부유물질 측정법을 준용하였으며, 1개의 강수량계에서 포집한 낙하먼지 현탁액 혹은 빗물을 직경 47 mm, 공극 크기(pore size) 1.2 μm인 GF/C로 여과하여 측정하였다(American public health association, 1996).
성능/효과
- , Alternaria alternata, Cladosporium 속, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus sp., Monascus ruber, Debaryozyma hansenii 등 7속 5종이 확인되었으며, Debaryozyma hansenii는 3월 4일의 시료에서만 분리되었다(Table 2).
- 포집한 낙하먼지로부터 최종적으로 87개 세균 집락의 순수배양을 얻었으며, 이중 45개 분리 세균의 16S rRNA 유전자 부분 염기서열을 대상으로 NCBI GenBank 데이터베이스의 등록된 서열과 비교하여 closest match를 조사하였다(Table 1). 16S rRNA 유전자 서열을 비교한 결과, 45개 분리 세균의 경우 Bacillus 속이 39개(87%), Staphylococcus 속이 6개(13%)였으며, 다른 속은 확인되지 않았다. 종별로 살펴보면 Bacillus 속의 B.
- 16회에 걸쳐 포집한 낙하먼지에 포함된 세균의 수는, 4월 22일 최소값인 40(±20) CFU에서 3월 4일 최대값인 32,400(±13,500) CFU의 범위였으며, 전체 평균과 중앙값은 각각 2,692 CFU와 385 CFU이었다.
- 18회에 걸쳐 포집한 낙하먼지에 포함된 진균의 수는, 4월 15일 최소값인 290(±10) CFU에서 3월 21일 최대값인 12,900(±450) CFU의 범위였으며, 전체 평균과 중앙값은 각각 3,257 CFU와 1,915 CFU이었다(Fig. 4).
- 1). 18회에 걸쳐 포집한 낙하먼지의 양은, 4월 15일 최소값인 1.0 mg에서 3월 4일 최대값인 24.3 mg의 범위였으며, 전체 평균과 중앙값은 각각 8.2 mg과 7.0 mg이었다. 84시간의 포집 시간에 황사가 발생한 날(3월 2일과 3일)이 포함된 3월 4일의 낙하먼지 양이 24.
- 잠정적으로 동정한 107개 집락으로부터 모두 12속 10종의 진균을 확인할 수 있었는데, Mucor sp.가 32개로 가장 많았고, 다음으로 Alternaria alternata 20개, Cladosporium 속 13개, Aspergillus 속 13개 등이었으며, yeast인 Saccharomyces cerevisiae와 Schizosaccharomyces pombe가 각각 9개와 3개씩 이었다(Table 2). 이외에도 Ulocladium chartarum 6개, Monascus ruber 4개, Penicillium glabrum과 Rhizopus sp.
- 이외에도 Ulocladium chartarum 6개, Monascus ruber 4개, Penicillium glabrum과 Rhizopus sp.가 각 2개, Curvularia geniculata와 Debaryozyma hansenii가 각 1개씩 확인되었다(Table 2). 황사가 발생한 날이 포함된 3월 4일의 시료 로부터 모두 13개 집락의 순수배양을 얻었다.
- 하지만, 낙하먼지의 진균 농도는 비 황사 기간에 비해 황사 기간 동안 유의성 있게 증가하지 않았으며, 조사 기간 동안 세균에 비해 상대적으로 일정한 수준을 유지하였다. 낙하먼지 시료로부터 분리한 45개 세균의 16S rRNA 유전자 염기 서열을 분석 하였으며, 이들 세균은 Bacillus 속의 B. amyloliquefaciens, B. aryabhattai, B. atrophaeus, B. licheniformis, B. megaterium, B. methylotrophicus, B. pumilus, B. sonorensis, B. subtlis, B. vallismortis와 Staphylococcus 속의 S. epidermidis, S. succinus로 확인되었다. 진균의 경우 Mucor 속, Alternaria 속, Cladosporium 속, Aspergillus 속 등을 황사 기간 및 비 황사 기간의 시료에서 모두 확인할 수 있었다.
- 낙하먼지를 포집한 지점과 인접한 울산광역시 효문동의 공기중 미세먼지(PM10) 농도 자동측정망 결과를 살펴보면, 24시간 평균값의 경우 3월 2일 147.2 μg/m3, 3월 3일 385.1 μg/m3로, 3월 1일의 52.8 μg/m3, 그리고 비가 내린 3월 4일의 22.0 μg/m 3 에 비해 매우 높은 농도를 보였다.
- 2008년 2월부터 4월까지 울산 지역의 한 지점에서 직경 200 mm의 강수량계를 사용하여 낙하먼지를 포집하였으며, 조사 기간 동안 울산 지역에서 황사 현상은 3월 2일과 3일에 걸쳐 한번 발생하였다. 낙하먼지에 포함된 세균의 농도는, 황사 기간 동안 포집한 시료에서 황사가 없는 기간의 시료에 비해 크게 높았다. 하지만, 낙하먼지의 진균 농도는 비 황사 기간에 비해 황사 기간 동안 유의성 있게 증가하지 않았으며, 조사 기간 동안 세균에 비해 상대적으로 일정한 수준을 유지하였다.
- 낙하먼지의 세균수와 진균수를 비교해보면, 중앙값 기준으로 진균수가 세균수보다 5배 정도 더 높았다.
- 군집의 genomic DNA 추출에 의한 분자적 군집 분석의 경우 증식이 가능한 살아있는 미생물과 대사 활성이 없는 죽은 상태의 미생물을 구분하기가 힘들다는 것을 고려할 때, 황사에 의해 유입되는 미생물이 생태 계에 미치는 영향을 파악하기 위해서는 분자적 군집 분석과 함께 배양에 의한 미생물 분리 및 동정 시험을 함께 수행할 필요가 있다. 또한 본 연구에서는 배양 가능한 세균 중 Bacillus 속의 세균이 87%의 높은 빈도로 분리되었다. 하지만 Bacillus 속의 경우 16S rRNA 유전자 염기 서열만으로 종을 확정하는 것은 무리가 있으며, 분리한 세균에 대한 생리적, 생화학적 연구 및 장기간에 걸친 황사 먼지 시료의 채취와 분석이 필요하다고 생각된다.
- 본 연구에서 낙하먼지의 배양 가능한 세균 농도는 황사가 없는 날에 비해 황사 발생시 더 높은 반면, 진균 농도는 황사 발생 여부에 큰 영향을 받지 않았다. 1986년에서 1988년에 걸쳐 대전 근교에서 조사한 연구에서도 황사가 발생하는 4월의 공기중 세균 농도가 평상시에 비해 4.
- 본 연구에서 분리하여 동정한 낙하먼지 진균의 경우, 황사 발생과 관련 없이 Mucor 속, Alternaria 속, Cladosporium 속, Aspergillus 속의 순으로 많이 분포하였지만, 분리한 진균의 30%인 45개 집락은 형태적 특징만으로는 동정할 수가 없었다. 태안 지역의 경우, 황사 기간에는 Penicillium 속, Alternaria 속이, 비 황사 기간에는 Mucor 속, Cladosporium 속, Alternaria 속, Aspergillus 속, Penicillium 속 등이 주로 배양되었다(Bae et al.
- 본 연구에서 분리한 배양할 수 있는 낙하먼지 세균은 모두 Bacillus 속 또는 Staphylococcus 속이었으며, Bacillus 속 10종, Staphylococcus 속 2종의 세균이 확인되었다. 태안 지역에서 행한 조사에서도 황사 기간과 비 황사 기간에 채취한 시료 모두에서 Bacillus sp.
- 16S rRNA 유전자 서열을 비교한 결과, 45개 분리 세균의 경우 Bacillus 속이 39개(87%), Staphylococcus 속이 6개(13%)였으며, 다른 속은 확인되지 않았다. 종별로 살펴보면 Bacillus 속의 B. amyloliquefaciens, B. aryabhattai, B. atrophaeus, B. licheniformis, B. megaterium, B. methylotrophicus, B. pumilus, B. sonorensis, B. subtlis, B. vallismortis와 Staphylococcus 속의 S. epidermidis, S. succinus이 closest match로 선택되었다(Table 1).
- succinus로 확인되었다. 진균의 경우 Mucor 속, Alternaria 속, Cladosporium 속, Aspergillus 속 등을 황사 기간 및 비 황사 기간의 시료에서 모두 확인할 수 있었다. Bacillus 속과 같은 내생 포자를 형성하는 세균이 진균(포자)에 비해 황사 먼지에의 부착 및 이동과 더 연관이 있는 것으로 보인다.
- 낙하먼지에 포함된 세균의 농도는, 황사 기간 동안 포집한 시료에서 황사가 없는 기간의 시료에 비해 크게 높았다. 하지만, 낙하먼지의 진균 농도는 비 황사 기간에 비해 황사 기간 동안 유의성 있게 증가하지 않았으며, 조사 기간 동안 세균에 비해 상대적으로 일정한 수준을 유지하였다. 낙하먼지 시료로부터 분리한 45개 세균의 16S rRNA 유전자 염기 서열을 분석 하였으며, 이들 세균은 Bacillus 속의 B.
- 황사가 발생한 날이 포함된 3월 4일의 시료를 접종한 plate에서 얻은 11개 분리 세균의 경우 Staphylococcus epidermidis 1개를 제외한 나머지 10개는 모두 Bacillus 속의 B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus 등으로 확인되었으며, 이들 종은 황사가 없었던 날의 시료에서 분리한 세균에서도 확인되었다(Table 1).
후속연구
- 환경 시료에 존재하는 미생물의 일부만이 배양될 수 있다는 것은 널리 알려져 있다(Pace, 1997). 따라서 본 연구에서 얻은 결과는 실험에 사용한 배지에서 집락을 형성할 수 있는 세균과 진균에 한정한 것으로 낙하먼지에 존재하는 전체 미생물 군집을 반영하는 것은 아니라는 한계를 지닌다. 군집의 genomic DNA 추출에 의한 분자적 군집 분석의 경우 증식이 가능한 살아있는 미생물과 대사 활성이 없는 죽은 상태의 미생물을 구분하기가 힘들다는 것을 고려할 때, 황사에 의해 유입되는 미생물이 생태 계에 미치는 영향을 파악하기 위해서는 분자적 군집 분석과 함께 배양에 의한 미생물 분리 및 동정 시험을 함께 수행할 필요가 있다.
- 본 연구의 연구 기간 동안에 울산 지역의 황사 발생일수가 적어 황사 기간을 포함하는 시료를 충분히 얻지 못한 점이 있다. 2008년의 경우, 3월 2일과 3일 이외에 5월 31일에도 오전 1시에서 5시까지 황사주의보가 발령되었다(Korea meteorological administration, 2012).
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